肉鸡产业具有较快的周转期和较高的经济效益，但长期以来在育种过程对生长速率和饲料报酬的过分追求，导致当前的肉鸡品系生长发育速度极快[1]，脂肪沉积能力强，对各类应激较为敏感[2]。应激影响动物产品的品质，增加疾病风险[3]。因而了解应激反应的生物学基础，无论从科学角度还是从实际生产角度来看都至关重要[4]。有研究表明，饲养环境温度每增加1 ℃，鸡的体脂率增加0.8%，腹脂率增加1.6%[5]。此外，氧化应激也干扰机体正常的脂质代谢，导致肌纤维内的脂肪沉积量增加[6]。脂肪酸转运蛋白1(FATP1)可以作为脂肪沉积的候选基因参与脂肪酸的摄取和甘油三酯(TG)的沉积[7]。FATP1受到核转录调节因子——过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的调控[8]。组织肉碱脂酰转移酶1(CPT1)是脂肪酸β氧化过程中的限速酶[9]。所以本试验同时检测了脂肪代谢相关组织——肝脏、腹脂、胸肌和腿肌的PPARα、FATP1 mRNA表达量和CPT1含量，旨在研究糖皮质激素——地塞米松(DEX)引发的应激和饲粮脂肪水平影响家禽脂肪异位沉积的机制，为探索应激反应的内分泌调控机制和建立家禽应激的营养调控技术提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验选取1日龄爱拔益加(AA)雄性肉仔鸡300只，饲喂至22日龄时选取体重相近的200只，随机分成2个处理：低脂饲粮(LFD，代谢能12.7 MJ/kg，粗脂肪6.60%)处理；高脂饲粮(HFD，代谢能12.7 MJ/kg，粗脂肪9.50%)处理。每个处理10个重复，每个重复10只鸡。35日龄时每个处理下设2个子处理：以2.0 mg/kg BW皮下注射DEX(山东鲁抗辰欣药业有限公司)；皮下注射等体积的生理盐水(对照)。每个处理5个重复，每个重复10只鸡，自由采食和饮水。连续注射3 d。预试期为7 d(22~29日龄)，正试期为9 d(30~38日龄)。正试期结束后采集样品，采样前空腹12 h。每个子处理取10只鸡(2只/重复)，翅静脉采血，分离血浆后冷冻保存待测。采集血液后剖杀，剥离胸肌、腿肌、腹脂、肝脏并称重，取部分胸大肌、臀股二头肌、腹脂、肝脏组织样品分装后放入液氮中速冻，随后置于-80 ℃保存待测。
1.2 试验饲粮根据NRC(1994)推荐的肉鸡微量元素和维生素需要量，同时结合实际生产配制基础饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis) |
29~34日龄记录体重和采食量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。
剖杀后测定各组织器官重量，计算组织器官比重，计算公式如下：
组织器官比重=100×组织器官重量/体重。
利用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)法测定血液和组织中TG含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
利用肝素-镁比浊法测定血液中极低密度脂蛋白(VLDL)含量，具体操作参照Griffin等[10]的步骤，测定结果为450 nm处的吸光度值。
利用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定各组织中的CPT1含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
采用Trizol法提取各组织总RNA。将提取的总RNA反转录为cNDA(试剂盒购自Roche公司)，之后采用SYBR Green荧光染料法(试剂盒购自Roche公司)进行实时定量PCR(ABI公司的Q5型实时定量PCR仪)。各基因引物分别为GR(GenBank登录号DQ227738)：上游5′-CATGAACCTCGAAGCTCGCAAGA-3′，下游5′-ACCTCCAGCAGTGACACCAG-3′；PPARα(GenBank登录号AF163809)：上游5′-AGACACCCTTTCACCAGCATCC-3′，下游5′-AACCCTTACAACCTTCACAAGCA-3′；FATP1(GenBank登录号DQ352834)：上游5′-TCAGGAGATGTGTTGGTGATGGAT-3′，下游5′-CGTCTGGTTGAGGATGTGACTC-3′。目的基因的mRNA表达量用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA标准化。
1.4 数据统计分析数据统计全部采用SAS 8.0软件ANOVA程序进行单因素以及双因素方差分析。试验数据用平均值±标准误表示，P < 0.05为差异显著的判断标准。
2 结果与分析 2.1 饲粮脂肪水平对肉鸡生产性能的影响由表 2可以看出，不同脂肪水平的饲粮对平均日增重、平均日采食量、料重比无显著影响(P>0.05)。
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表 2 饲粮脂肪水平对肉鸡生产性能的影响(29~34日龄) Table 2 Effects of dietary fat level on growth performance of broilers (29 to 34 days of age) |
由表 3可以看出，2种饲粮饲喂条件下，与对照子处理相比，糖皮质激素均显著降低了肉鸡的体重和腿肌重(P < 0.05)，显著提高了肝脏重和肝脏比重(P < 0.05)，胸肌重以及腿肌比重没有显著变化(P>0.05)。LFD饲喂条件下，糖皮质激素显著提高了腹脂比重和胸肌比重(P < 0.05)，腹脂重有增加的趋势(0.05≤P < 0.10)；而在HFD饲喂条件下，糖皮质激素对腹脂比重和胸肌比重无显著影响(P>0.05)，腹脂重有降低的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 3 糖皮质激素和饲粮脂肪水平对肉鸡组织器官发育的影响 Table 3 Effects of glucocorticoid and dietary fat level on tissue and organ development of broilers |
由表 4可以看出，LFD饲喂条件下，糖皮质激素显著提高了胸肌、腿肌的TG含量(P < 0.05)，肝脏的TG含量有增加的趋势(0.05≤P < 0.10)，对腹脂的TG含量无显著影响(P>0.05)；HFD饲喂条件下，糖皮质激素对胸肌、肝脏、腹脂TG含量无显著影响(P>0.05)，腿肌TG含量有增加的趋势(0.05≤P < 0.10)。无论饲喂LFD还是HFD条件下，糖皮质激素对血液中VLDL含量均无显著影响(P>0.05)，但均显著提高了血液的TG含量(P < 0.05)。
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表 4 糖皮质激素和饲粮脂肪水平对肉鸡脂质代谢指标的影响 Table 4 Effects of glucocorticoid and dietary fat level on lipid metabolic indices of broilers |
由表 5可以看出，LFD饲喂条件下，糖皮质激素对肝脏、胸肌和腿肌的CPT1含量无显著影响(P>0.05)，但显著提高了腹脂的CPT1含量(P < 0.05)；HFD饲喂条件下，糖皮质激素导致肝脏和胸肌的CPT1含量显著下降(P < 0.05)，而腹脂和腿肌的CPT1含量显著上升(P < 0.05)。
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表 5 糖皮质激素和饲粮脂肪水平对肉鸡组织器官CPT1含量的影响 Table 5 Effects of glucocorticoid and dietary fat level on CPT1 content in organs and tissues of broilers |
由表 6可以看出，LFD饲喂条件下，糖皮质激素显著降低肝脏GR、PPARα和FATP1的mRNA表达量(P < 0.05)，胸肌FATP1 mRNA表达量有升高的趋势(0.05 < P < 0.10)，腿肌GR mRNA表达量有降低的趋势(0.05≤P < 0.10)。HFD饲喂条件下，糖皮质激素显著降低肝脏的GR mRNA表达量(P < 0.05)，显著提高腹脂的PPARα和FATP1 mRNA表达量(P < 0.05)，腹脂的GR mRNA表达量有升高的趋势(0.05≤P < 0.10)，显著提高胸肌FATP1 mRNA表达量(P < 0.05)。
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表 6 糖皮质激素和饲粮脂肪水平对肉鸡脂质代谢相关基因mRNA表达量的影响 Table 6 Effects of glucocorticoid and dietary fat level on mRNA expression levels of genes related to lipid metabolism in broilers |
应激发生时，下丘脑-垂体-肾上腺轴激活释放的糖皮质激素被用于维持体内能量平衡和代谢稳定[11]。此时，机体对能量的需要量增加，能量重新分配[12]，脂肪酸向骨骼肌等非脂肪组织转移，从而发生脂肪异位沉积现象[13]。肉鸡上的研究表明，糖皮质激素升高导致脂肪酸从头合成能力增强，骨骼肌内脂肪异位沉积量增加[14]。本实验室近年来在肉鸡上的研究表明，按2.0 mg/kg BW注射一种人工合成的糖皮质激素3~7 d，能够成功诱导肉鸡的糖脂代谢发生改变[15]。本试验发现，等能量的HFD、LFD饲喂肉鸡不会影响生产性能，但不管饲喂何种饲粮，糖皮质激素处理均降低了肉鸡的体重、抑制了腿肌的发育、提高了肝脏比重、并提高了血液TG含量，这提示糖皮质激素调控脂肪代谢，使机体能量重新分配。
饲喂LFD时，糖皮质激素处理显著提高了腹脂比重及胸肌、腿肌的TG含量，肝脏的TG含量有提高的趋势，而饲喂HFD时糖皮质激素并无上述效应，说明在脂肪相对缺乏时，糖皮质激素促进了脂肪的沉积，包括在腹部皮下的沉积以及在肌肉和肝脏的异位沉积，而在脂肪相对充足时能够缓解糖皮质激素的这一调控作用。这进一步证实了应激反应导致机体对能量的需要增加，以及糖皮质激素对机体能量分配的调控作用。已有研究表明，糖皮质激素上调肝脏脂类合成相关基因脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、苹果酸酶(ME)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)的表达，下调载脂蛋白的表达[16]，说明糖皮质激素导致肝脏脂肪从头合成增多，但是肝脏中大量合成的TG不能完全与载脂蛋白结合装配成VLDL，这与本试验中肝脏TG含量增多而血液VLDL含量无显著变化的结果相一致。
CPT1是脂肪酸β氧化过程中的限速酶[17]。HFD饲喂后，糖皮质激素提高了腹脂和腿肌的CPT1含量，降低了肝脏和胸肌的CPT1含量，说明HFD饲喂肉鸡时应激促进了腹脂和腿肌的脂肪酸β氧化而抑制了肝脏和胸肌的脂肪酸β氧化。作者推测，LFD饲喂的肉鸡受到应激时，由于饲粮中脂肪含量较低，机体无法快速启动组织的脂肪酸氧化机制提供能量，当HFD饲喂的肉鸡受到应激时，腹脂和腿肌可以通过激活组织CPT1，促进脂肪酸的氧化利用，从而缓解应激造成的脂肪沉积现象。饲喂HFD时糖皮质激素促进腿肌的CPT1合成而抑制胸肌的CPT1合成，之前的研究也发现糖皮质激素促进腿肌而抑制胸肌的CPT1 mRNA表达[14]，这可能与腿肌是氧化型红肌而胸肌是酵解型白肌有关[13]。
FATP1是第1个被发现的溶质携带家族成员，也是最为重要的一种载脂蛋白[18]。研究表明，FATP1能够特异性结合脂肪酸(特别是长链和超长链脂肪酸)并运输它们通过细胞膜[19]。研究认为，FATP1在机体的糖脂代谢方面发挥着重要作用，甚至将FATP1作为治疗过度肥胖和二型糖尿病的一个重要靶点[20]。在哺乳动物上的研究发现，FATP1能够促进细胞内脂肪酸的酯化沉积，而敲除FATP1基因之后可以减少肌肉组织中TG的沉积[21]，即使饲喂HFD也未发生脂肪沉积和胰岛素抵抗[22]。鸡上的研究也表明，FATP1与肉鸡屠体性状有相关性[23]。FATP1受到核转录调节因子——PPAR的调控[8]。研究发现，在机体脂肪沉积量增加时，PPARα及其调控的靶基因表达量均升高[24]。PPARα能够通过脂肪酸转运蛋白(FATP)影响脂肪酸的摄取和酯化沉积[23]，PPARα基因沉默时FATP和长链脂肪酸的摄取均减少[24]。鸡PPARα的组织特异性分布与哺乳动物相似[25]，PPAR基因可以作为家禽脂肪性状的候选基因。Meng等[26]和解相林等[25]的研究中均提出，PPARα是影响肉鸡脂肪代谢的主效基因之一。Cui等[27]对2种脂肪沉积能力不同的肉鸡品系进行比较，发现PPAR信号通路参与了脂肪的沉积。所以本试验同时检测了脂肪合成的位点肝脏、脂肪储存的位点腹脂、脂肪的利用位点胸肌和腿肌中PPARα和FATP1 mRNA表达量。本试验结果表明，糖皮质激素处理导致GR、PPARα、FATP1 mRNA表达量在腹脂和胸肌中大体呈上调趋势，而在肝脏和腿肌中大体呈下降趋势，这说明糖皮质激素对脂肪代谢的调控具有组织特异性。但糖皮质激素处理对各组织中GR、PPARα、FATP1 mRNA表达量的影响规律基本一致，这进一步表明糖皮质激素可能通过GR-PPARα通路调控了FATP1基因的表达。
4 结论① 糖皮质激素导致肉鸡体内的能量发生重分配，促进了脂肪在腹部皮下的沉积以及在肌肉和肝脏的异位沉积，而抑制了肌肉发育和体重增长。
② 糖皮质激素对GR、PPARα、FATP1 mRNA表达的调控具有组织特异性，糖皮质激素可能通过GR-PPARα-FATP1调控肉鸡的脂肪沉积。
③ 饲粮脂肪水平能够影响糖皮质激素的调控效应，HFD可能通过激活腹脂和腿肌的CPT1，促进脂肪酸的氧化利用，从而缓解糖皮质激素导致的脂肪沉积现象。
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