家兔作为一种小型节粮草食动物，饲粮中纤维质量和含量与其健康密切相关[1]。目前，优质的苜蓿草粉可为家兔提供部分纤维，但其资源有限，价格昂贵，影响了养兔业的经济效益[2]。因此，新型粗饲料的开发具有重要意义。薏苡本身为禾本科植物，研究表明，不仅薏苡仁中富含蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、矿物质、维生素等多种营养物质，而且其根、茎、叶中同样含有丰富的氨基酸、矿物质等多种营养成分，具有极高的饲用价值[3-4]。此外，薏苡对治疗胃肠道健康作用明显[3-6]。薏苡胚乳及麸皮和去壳薏苡的乙醇提取物在保护胃肠道健康，调节肠道微生物方面有明显效果[6-8]。薏苡仁可改善肠道的屏障功能，缓解腹泻，增加肠道中的乳酸杆菌数量及挥发性脂肪酸含量[8-11]。生薏仁粉可促进小鼠胃肠动力，经过中药炮制方法麸炒后的薏仁粉具有止泻的作用[12]。去壳发酵薏苡可以平衡仓鼠盲肠生物种群[13]。薏苡仁中的抗性淀粉可降低小鼠肠道中的致病菌数量，增加双歧杆菌数量，改善肠道组织形态[14]。薏苡仁油复乳可促进肠道吸收[15]。同时青贮薏苡秸秆可促进纤维分解菌的繁殖[16]。综上可见，薏苡仁及相关产品对肠道健康有一定的调节和保护作用，且在动物试验中也获得较好的生长性能[17-19]。但是目前薏苡应用于家兔饲粮中对其肠道健康的影响未见报道。经本课题组前期研究发现，大黑山薏苡草粉营养成分丰富，对家兔具有较高的营养价值，并获得了较理想的生长性能及养分消化率[17, 19]。因此，本试验在之前研究的基础上，进一步研究大黑山薏苡草粉替代饲粮中苜蓿草粉对家兔肠道形态、肠道酶活性及盲肠发酵参数的影响，最终为家兔饲料的开发提供更有力的参考价值。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验采用单因素试验设计。按体重相近原则，随机将100只35日龄的新西兰断奶纯种白兔分为5组，每组10个重复，每个重复2只兔。对照组(C组)和4个替代组(S25、S50、S75和S100组)分别饲喂5种不同比例(0、25%、50%、75%和100%)大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉的饲粮。试验期15 d。对照组饲粮的消化能及粗蛋白质、粗纤维的含量分别为11.28 MJ/kg、17.50%、17.14%，大黑山薏苡草粉的消化能及粗蛋白质、粗纤维的含量分别为5.69 MJ/kg、13.46%、29.58%，苜蓿草粉的消化能及粗蛋白质、粗纤维的含量分别为7.40 MJ/kg、15.30%、26.10%。试验饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
以重复为单位，每日称重并记录给料量、余料量和浪费料量，试验开始和结束时早晨喂料前称重每只动物，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.2.2 肠道形态试验第15天早晨空腹称重试验兔后，从各组不同重复选取4只接近平均体重的动物(未考虑性别)，参照Blasco等[20]方法进行屠宰。动物屠宰后，分离各肠段，生理盐水轻轻冲洗内容物并将各段取2~3 cm，置于4%的多聚甲醛溶液中保存，用于切片制作。各组样品送于成都里来生物科技有限公司进行苏木精-伊红(HE)染色，测定十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)、绒毛高度/隐窝深度(V/C)以及盲肠CD。
1.2.3 肠道消化酶活性考虑到大黑山薏苡草粉和饲粮中纤维和粗蛋白质含量都较高，故选择性地测定了肠道中胰蛋白酶、蔗糖酶、果胶酶和纤维素酶的活性。
动物屠宰后，取出小肠并分离各肠段，生理盐水冲洗内容物，纵向剖开，载玻片刮取黏膜，用于测定小肠各段中胰蛋白酶和蔗糖酶活性；同时收集盲肠内容物于冻存管中，用于测定盲肠中果胶酶和纤维素酶活性。所有样品暂存于液氮中。所有酶活性测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，方法按相应试剂盒说明书执行。
1.2.4 盲肠发酵参数动物屠宰后，取出盲肠，立即用pH-3B型酸度计测定盲肠内容物pH(选取3个不同位置)。盲肠内容物样品经前处理后用瓦里安CP-3800型气相色谱仪测定总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)含量[21]。氨态氮(NH3-N)含量采用比色法(波长700 nm)测定[22]。此外，同时收取C组和S100组动物的盲肠内容物样品，装于灭菌后的冻存管中，样品送于中国科学院成都生物公司采用16S rRNA的二代测序方法测定微生物在门水平及在属水平上的组成。
1.3 数据处理与统计分析采用Excel 2013初步整理数据，采用SAS 9.20进行单因子方差分析及Duncan氏法多重比较。P＜0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 不同比例大黑山薏苡草粉替代饲粮中苜蓿草粉对生长肉兔生长性能的影响由表 2可知，各组间ADFI、ADG和F/G均无显著差异(P>0.05)。
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表 2 饲喂含不同比例大黑山薏苡草粉饲粮生长肉兔的生长性能 Table 2 Growth performance of growing meat rabbits fed diets with different proportions of Coix lacryma-jobi cv. Daheishan meal |
由表 3可知，各组的十二指肠、空肠、回肠的VH、CD和V/C及盲肠的CD均无显著差异(P>0.05)，其中V/C整体趋势以S50组较优。
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表 3 饲喂含不同比例大黑山薏苡草粉饲粮生长肉兔的肠道形态 Table 3 Intestinal morphology of growing meat rabbits fed diets with different proportions of Coix lacryma-jobi cv. Daheishan meal |
由表 4可知，除十二指肠中蔗糖酶活性外，其他各肠道各消化酶活性均无显著差异(P>0.05)，均以S50组活性相对较高。其中，S50组十二指肠中蔗糖酶活性显著高于S75和S100组(P＜0.05)，与其他各组无显著差异(P>0.05)。
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表 4 饲喂含不同比例大黑山薏苡草粉饲粮生长肉兔的肠道消化酶活性 Table 4 Intestinal digestive enzyme activities of growing meat rabbits fed diets with different proportions of Coix lacryma-jobi cv. Daheishan meal |
由表 5可知，各组的盲肠pH及NH3-N、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量以及乙酸/(丙酸+丁酸)均无显著差异(P>0.05)。其中，盲肠NH3-N含量以S50组较高。同时，C组和S100组之间的盲肠微生物在门水平及属水平的组成均无明显差异(图 1和图 2)。
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表 5 饲喂含不同比例大黑山薏苡草粉饲粮生长肉兔的盲肠发酵参数 Table 5 Cecal fermentation parameters of growing meat rabbits fed diets with different proportions of Coix lacryma-jobi cv. Daheishan meal |
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图中T表示对照组(C组)，Hm表示S100组。图 2同。 In the figure, T represents the control group (C group), and Hm represents the S100 group. The same as Fig. 2. 图 1 盲肠微生物门水平上的分布 Figure 1 Caecal microbial distribution at the phylum level |
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图 2 盲肠微生物属水平上的分布 Figure 2 Caecal microbial distribution at the genus level |
小肠是家兔消化和吸收养分的主要场所，其绒毛的物理作用与隐窝的化学作用联合发挥作用，促进养分的消化与吸收[23]。因此，小肠VH、CD和V/C可反映肠道的发育状况与消化吸收养分的能力。研究表明，纤维的来源影响家兔肠道形态[24-25]。中草药饲料添加剂中的有效成分(有机酸、黄酮类、生物碱等)可一定程度促进家兔肠道黏膜结构完整，并改善肠道结构[26]。本试验结果显示，替代组的小肠中VH和V/C在一定程度上有所增加，CD基本接近。可见大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉后，可一定程度促进家兔对营养物质的消化吸收，且对动物的肠道发育无不利影响，这与薏苡仁在小鼠上的试验结果[27]相似。这与前期报道的饲粮中营养物质消化率及动物生长性能的结果[19]相匹配。分析其原因可能是大黑山薏苡草粉中含有与薏苡仁中相似的抗性淀粉，对家兔的肠道组织形态有一定的改善作用，同时增加了有益菌的增殖，进而促进家兔的消化能力[9-11, 14]。
3.2 不同比例大黑山薏苡草粉替代饲粮中苜蓿草粉对生长肉兔肠道消化酶活性的影响在动物消化代谢中，小肠黏膜中的消化酶发挥主要作用[28]。蔗糖酶来源于肠道脱落的肠上皮细胞，分解饲粮中的双糖为单糖，进而被动物吸收利用[29]。胰蛋白酶主要由胰腺分泌，主要反映动物对饲粮中的粗蛋白质的消化能力。维素酶和果胶酶主要由家兔盲肠中微生物产生，其活性受饲粮中纤维水平、来源的影响[30-32]。研究表明，中草药成分可一定程度激活小肠中的蔗糖酶活性[33]。同时随着动物的生长发育，二糖酶在成年期动物肠道中空肠中的蔗糖酶活性高于十二指肠和回肠[34]。本试验中蔗糖酶的活性以空肠较高，十二指肠和回肠次之，这与Siddons[35]的研究结果一致，且与动物的生长发育一致。胰蛋白酶活性以回肠较高，其次为空肠，十二指肠最低。这说明蛋白质的消化主要在小肠的后半段。此外，本试验结果发现，替代组小肠各段酶活性(十二指肠蔗糖酶活性除外)均不同程度高于对照组，且以S50组较高。可见大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉后对小肠各段的消化酶活性无负面影响，并在一定程度上提高了试验兔肠道中的消化酶的活性。该结果与大黑山薏苡草粉对饲粮中的养分消化率结果[19]相符。这可能与大黑山薏苡草粉中的功能性物质有一定的联系[3, 6]。
3.3 不同比例大黑山薏苡草粉替代饲粮中苜蓿草粉对生长肉兔盲肠发酵参数及微生物组成的影响盲肠作为家兔最重要的消化器官之一，其内环境影响微生物的生长与繁殖，进而影响家兔健康[32]。其中盲肠pH及氨态氮、挥发性脂肪酸含量是评定家兔肠道健康的重要指标。其中，NH3-N是主要的蛋白质分解产物，也是盲肠微生物合成菌体蛋白的重要底物[36]。此外，盲肠内挥发性脂肪酸中的短链脂肪酸在家兔的营养代谢及能量提供中发挥重要作用[37]。研究表明，盲肠pH增加会引起家兔腹泻率增加[38]。本试验中对照组盲肠pH略高于替代组，与前期试验兔的发病率(主要特征为腹泻)结果[19]相匹配，这可能是大黑山薏苡草粉中含有与薏苡仁中同样的抗腹泻的活性成分，间接影响了盲肠中的pH[3-4, 6, 10-11]。此外，本试验中替代组盲肠NH3-N含量均大于对照组，分析原因可能是替代后，提高了试验肉兔对蛋白质的利用，增加盲肠中的分解产物，进而增加了NH3-N的含量。分析原因，可能与本试验中动物对饲粮中的粗蛋白质消化率有关[21]。另外，Gidenne等[32]研究表明，饲粮中的纤维水平与挥发性脂肪酸的含量呈正相关，且提高乙酸比例，降低丁酸比例。并且饲粮中纤维的木质化程度对挥发性脂肪酸有负面影响[39]。本试验中，替代组的挥发性脂肪酸含量不同程度地高于对照组。这可能与大黑山薏苡草粉中的纤维组分的组成及类型有一定的关系，该结果与去壳薏苡在小鼠上的研究结果[11, 16]相似。同时，微生物的变化，可改变盲肠内环境，从C组与S100组的盲肠微生物对比结果，可以进一步支撑盲肠参数的结果，证明大黑山薏苡草粉可以完全替代苜蓿草粉。
4 结论综上所述，大黑山薏苡草粉替代饲粮中苜蓿草粉对生长肉兔的肠道形态、肠道酶活性及盲肠发酵参数和微生物组成均无不利影响。本试验结果更进一步证明，大黑山薏苡草粉可以替代苜蓿草粉用于商品肉兔饲粮，建议替代比例为50%。
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