应激导致家禽能量代谢异常，阐明糖皮质激素影响肝脏脂肪、胆汁酸合成的途径对揭示应激机理、制定防控策略意义重大。糖皮质激素参与机体脂肪代谢，肥胖糖尿病小鼠模型和一些胰岛素抵抗患者体内糖皮质激素水平升高，并与脂肪肝和高血糖的发生相关[1-2]。合成的和天然的糖皮质激素都能够高度调节肝脏脂肪代谢，在小鼠原代肝细胞上的研究表明，地塞米松(dexamethasone，DEX)促进蛋白质依赖性脂肪酸的摄取，增加三酰甘油和鞘脂的积累[3]。此外，糖皮质激素参与胆汁酸代谢，小鼠肝脏特异性敲除糖皮质激素受体基因后，胆囊中胆汁酸的含量降低[4]；糖皮质激素通过诱导胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase, CYP7A1)的活性来调节大鼠肝细胞中胆汁酸的合成[5]。肉鸡饮水中添加地塞米松抑制了三羧酸循环和脂肪酸氧化，促进了肉鸡肝脏脂肪酸从头合成[6]。目前，有关应激调控家禽肝脏代谢的研究多基于活体试验，所得结果是糖皮质激素、胰岛素等多个因素的共同影响，尚需通过体外试验探究糖皮质激素的直接效应。因此，本试验使用不同浓度的地塞米松处理鸡胚肝细胞，通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对脂肪、胆汁酸合成相关基因进行定量，以揭示糖皮质激素的单一影响，为深入研究应激影响家禽能量代谢的机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料地塞米松注射液(5 mg/mL)购自山东鲁抗晨欣药业有限公司，RNA提取试剂盒购自康为试剂生物有限公司(CW0584)，反转录试剂盒(编号：4897030001)购自罗氏公司，Real Time PCR试剂盒(编号：4913914001)购自罗氏公司。固醇调节元件结合蛋白-1C(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1C)、肝脏X受体(liver X receptor, LXR)、载脂蛋白B(apolipoprotein B, APOB)100、脂肪酸转运蛋白1(fatty acid transport protein 1, FATP-1)、CYP7A1、法尼酯X受体(farnesoid X receptor, FXR)、胆盐输出泵(bile salt export pump, BSEP)和胆汁酸摄取相关基因Na+/牛磺胆盐共转运体(Na+/taurocholate co-transporting polypeptide, NTCP)基因的引物序列见表 1，由上海生工生物技术有限公司合成。采用2-ΔΔCT法[7]定量目标基因的mRNA相对表达水平，以β-肌动蛋白(β-actin)作为参照基因进行校准。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
选取19胚龄的无特定病原体(SPF)鸡蛋，原代培养鸡胚肝细胞，细胞以1×106个/mL密度接种于6孔板中，每个孔作为1个重复，常规(37 ℃、5% CO2)培养，每24 h更换一次培养液。培养72 h后根据试验处理不同分别加入0(对照)、200、500和1 000 nmol/L的地塞米松，继续培养24 h后分别收集细胞上清液、肝细胞，利用RT-PCR技术进行基因定量。
1.3 基因定量反转录条件为：55 ℃，30 min(反转录反应)；85 ℃，5 min(反转录酶的失活反应)。两步法荧光定量PCR反应条件为：第1步95 ℃变性10 s，1个循环，第2步95 ℃延伸5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。
1.4 统计分析使用SAS 9.0软件中GLM程序对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，平均值采用Tukey’s HSD法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 地塞米松对鸡胚肝细胞脂肪代谢相关基因mRNA相对表达水平的影响由图 1-A、图 1-C、图 1-D可知，与对照组相比，500和1 000 nmol/L地塞米松处理分别显著降低了鸡胚肝细胞FATP-1、APOB100和LXR的mRNA相对表达水平(P＜0.05)；由图 1-B可知，200、500、1 000 nmol/L地塞米松处理均显著降低了鸡胚肝细胞SREBP-1C的mRNA相对表达水平(P＜0.05)。
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数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下图同。 Value columns with the same small letter mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 地塞米松对鸡胚肝细胞脂肪代谢相关基因mRNA相对表达水平的影响 Figure 1 Effects of DEX on mRNA relative expression levels of fat metabolism related genes in chicken embryo hepatocyte |
由图 2-A、图 2-B可知，与对照组相比，200 nmol/L地塞米松处理显著提高了鸡胚肝细胞CYP7A1和FXR的mRNA相对表达水平(P＜0.05)；由图 2-C可知，500和1 000 nmol/L地塞米松处理显著降低了鸡胚肝细胞NTCP的mRNA相对表达水平(P＜0.05)；由图 2-D可知，200、500和1 000 nmol/L地塞米松处理均显著提高了鸡胚肝细胞BSEP的mRNA相对表达水平(P＜0.05)。
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图 2 地塞米松对鸡胚肝细胞胆汁酸代谢相关mRNA相对表达水平的影响 Figure 2 Effects of DEX on mRNA relative expression levels of bile acid metabolism in chicken embryo hepatocyte |
在禽类，脂肪酸的合成反应与哺乳动物相同，脂肪酸和甘油三酯的合成主要在肝脏，并受多种蛋白质的调节。有研究表明，糖皮质激素与脂肪代谢密切相关，大鼠按0.05 mg/kg剂量每天灌服地塞米松7周后，肝脏脂肪含量下降，脂肪合成相关基因：脂肪酸结合蛋白-1(FABP-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(GPAT)基因在肝脏中的mRNA相对表达水平下降[8]，提示地塞米松具有抑制脂肪合成的作用。在肝脏，脂肪酸可以通过脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport protein，FATP)家族介导的主动吸收穿越质膜，其中FATP-1可以促进长链脂肪酸进出细胞的通量，此外，FATP-1可通过调节细胞内脂肪酸酰化作用而影响细胞内脂肪酸代谢和脂质蓄积[9-10]。在本研究中，高剂量地塞米松处理显著降低了鸡胚肝细胞FATP-1的mRNA相对表达水平，表明糖皮质激素对肝细胞脂肪酸合成具有抑制作用。
LXR和SREBP-1C同样在脂肪合成过程中发挥关键作用。LXR是胆固醇水平的感受器，并能调节与胆固醇吸收、转运、流出、排泄有关的一系列基因，其过度表达会使脂肪合成相关酶的基因转录明显加强。在朗德鹅上的研究发现，LXRα的mRNA相对表达水平增加可促进鹅肝脏脂肪沉积[11]。在甘油三酯的合成中，脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A(ACC)是限速酶。FAS和ACC的表达受SREBP-1C的调控[12]。当细胞内胆固醇含量过高，LXRs激活SREBP-1C，后者可增加油酸的合成，增多的不饱和脂肪酸与过多的胆固醇酯化，从而促进胆固醇的储存；而减少LXRs的激活可抑制SREBP-1C的转录，从而减少脂肪形成和甘油三酯合成。在本研究中，高剂量地塞米松处理显著降低了LXR和SREBP-1C的mRNA相对表达水平，同样表明糖皮质激素对脂肪合成具有抑制作用。
APOB是极低密度脂蛋白(VLDL)的组成成分，是脂蛋白合成、分泌、运输的骨架蛋白，对能量转运、代谢等有显著作用。VLDL将甘油三酯从肝脏运送到外周组织，肝细胞内过量合成APOB导致血浆中VLDL和低密度脂蛋白(LDL)含量升高，可引发动脉粥样硬化等心脑血管疾病，还可导致肝脏细胞内脂质积累，引发脂肪肝[13]。此外，鸡APOB基因SNP(T123G)对腹脂和腹脂率有显著影响[14-15]。在本研究中，高剂量地塞米松处理显著下调了肝细胞APOB100的mRNA相对表达水平，提示糖皮质激素具有抑制脂蛋白组装转运的作用。
3.2 糖皮质激素与鸡胚肝细胞胆汁酸代谢胆汁酸在肝脏实质细胞中由胆固醇合成，CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶[16]。研究表明，糖皮质激素对胆汁酸合成具有剂量依赖性刺激作用，50 nmol/L地塞米松处理大鼠肝细胞发现，第2天和第3天胆汁酸的合成水平分别上升了3倍和7倍；1 μmol/L地塞米松处理2 d后，肝细胞胆汁酸合成水平上升了2.2倍[17]。糖皮质激素通过诱导CYP7A1活性调节大鼠肝细胞胆汁酸合成[5]。地塞米松和甲状腺素联合作用能显著提升人和大鼠肝细胞中总胆汁酸的合成，使胆酸的含量提高了23%，二羟胆酸的含量提高了77%，CYP7A1的活性也提高，在培养的肝细胞上，27-羟化酶mRNA并不自然出现，培养液中添加地塞米松72 h后，27-羟化酶mRNA出现，说明地塞米松可提高CYP7A1和固醇27羟化酶的活性, 从而调节胆汁酸合成[18]。与前人研究相似，本研究中低水平地塞米松处理促进了CYP7A1的mRNA相对表达水平，证实了糖皮质激素可促进胆汁酸的合成。
NTCP位于肝细胞基底膜，是摄取胆汁酸的主要转运体。有报道证明，地塞米松是大鼠肝脏中BSEP的强效诱导剂，大鼠肝细胞在100 nmol/L地塞米松的培养基中培养4 d后，BSEP具有较强的功能活性[17]，这与本研究中地塞米松诱导BSEP的mRNA相对表达水平上升的结果相一致。
有研究表明，CYP7A1受到FXR的负反馈调控，在肝脏中，FXR通过激活下游靶基因SHP抑制CYP7A1的表达，减少了胆汁酸的合成[19-20]。此外，肝脏中的FXR被胆汁激活后，下调了NTCP的基因表达，提高了胆汁酸外流转运体BSEP的基因表达[21-22]。在本研究中，200 nmol/L地塞米松处理促进了鸡肝细胞CYP7A1和FXR的mRNA相对表达水平，500和1 000 nmol/L地塞米松处理抑制了NTCP的mRNA相对表达水平，提高了BSEP的mRNA相对表达水平，提示低水平糖皮质激素可以促进鸡胚肝细胞胆汁酸的合成和排出，高水平糖皮质激素抑制胆汁酸摄取。
4 结论高剂量糖皮质激素对鸡胚肝细胞的脂肪合成、转运和胆汁酸的摄取具有抑制作用；低剂量糖皮质激素可以促进胆汁酸的合成和排出，部分反应具有剂量依赖性。
致谢: 感谢山东农业大学动物科技学院赵景鹏老师对论文撰写的指导。| [1] |
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