反刍动物胃肠道内的微生物发酵所产生的甲烷(CH₄)是畜牧产业甲烷产生的主要途径。据报道, 每年全球反刍动物胃肠道CH₄的排放量约占农业领域总CH₄排放量的58%^[1], 而占世界总CH₄排放量高达28%^[2]。其中肉牛和奶牛所排放的CH₄占74%^[3]。随着全球温室效应的逐渐加剧, 如何减少反刍动物瘤胃CH₄排放成为一个热点问题。大量研究表明, 化学饲料添加剂^[4]、抗生素^[5]、CH₄抑制剂^[6]和植物提取物^[7]等均可改善反刍动物生产性能及减少CH₄排放。然而, 动物产品中化学残留问题、抗生素的细菌耐药性以及一些添加剂的过量毒性和成本问题限制了它们在动物营养中的利用^[8]。因此, 科学界仍在积极寻求可以提高瘤胃功能的饲料添加剂, 在改善瘤胃发酵的同时有利于生态环境健康可持续发展。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基得到的产物, 是天然高分子质量化合物。壳聚糖化学名称是β-(1, 4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。20世纪70年代以来, 人们对壳聚糖的研究有了很大的进步, 已被作为“人体第六生命要素”进行深入研究和开发^[9]。近年来, 关于壳聚糖用于饲料添加剂改善瘤胃发酵的报道很多, 李朝云等^[10]的研究发现精粗比20 : 80和50 : 50时, 添加壳聚糖能够显著增加山羊瘤胃液丙酸的摩尔比例, 降低乙丙比; Henry等^[11]的研究结果表明, 在肉牛的饲粮中加入壳聚糖可以使肉牛的CH₄排放量显著下降。这些研究结果表明, 在饲粮中添加壳聚糖对反刍动物瘤胃发酵及CH₄产量会有一定影响, 但有关其影响奶牛瘤胃发酵参数的报道不多且试验结果不一致。因此, 本研究旨在探究不同分子质量及不同浓度的壳聚糖对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响, 旨在为壳聚糖作为反刍动物饲料添加剂实际应用提供科学依据和理论支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所选用的壳聚糖分子质量分别为1 000、3 000和50 000 u, 均购自浙江金壳药业有限公司, 脱乙酰度85%以上, 纯度均在95%以上。

1.2 试验动物及饲养管理

试验选用3头体况相近、健康状况良好、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液的供体。每日08:00和18:00饲喂全混合日粮, 其组成及营养水平见表 1。

1.3 发酵底物配制

发酵底物主要由蒸汽压片玉米、豆粕、羊草、苜蓿组成, 将饲料原料65 ℃烘干48 h, 充分研磨过1 mm筛, 按照底物配比, 称取各原料, 混匀待用。发酵底物组成及营养水平见表 2。

1.4 试验设计及方法

试验采集早饲前奶牛瘤胃液进行体外发酵, 从每头牛的瘤胃采集0.5 L瘤胃液, 均匀混合, 用4层纱布过滤。

试验选择分子质量分别为1 000、3 000和50 000 u的壳聚糖, 每种分子质量的壳聚糖再分别以底物0.4%、0.8%及1.6%的浓度添加到底物中, 共设9个试验组, 另外设1组对照组(不添加壳聚糖), 每组4个重复, 共重复3个批次。

按Menke等^[13]方法进行体外发酵试验, 体外发酵液人工唾液盐的配制见表 3。取新鲜瘤胃液与人工唾液盐混合液(瘤胃液:人工唾液盐=1 : 2)70 mL加入发酵瓶中。向瓶中持续通入CO₂ 5 s后, 立即加上瓶塞, 并将每个发酵瓶与产气装置的每个传感器相连接, 后面连接气袋以收集瘤胃体外发酵所产的气体, 于39 ℃下连续培养24 h, 试验重复3次。

使用SartoriusPB-20型pH计测定瘤胃培养液的pH。使用AGRS-Ⅲ微生物发酵微量产气自动记录仪测定24 h产气量。气袋收集发酵24 h后的气体。使用安捷伦7890B型号气相色谱仪用比色法测定瘤胃培养液的CH₄产量。色谱仪条件为:热导池(TCD)检测器, 载气为氢气, 流量28 mL/min, PorapakQ填充柱, 检测器温度100 ℃, 进样口温度150 ℃, 柱温38 ℃, 进样量1 mL。

干物质消化率的测定参考Tilley等^[14]的方法。将发酵瓶内残渣用纱布过滤收集, 用蒸馏水冲洗2次至50 mL离心管中, 在4 ℃, 5 400×g转速下离心15 min, 在烘箱中以105 ℃烘干24 h, 计算饲料干物质消化率。干物质消化率计算公式为:

挥发性脂肪酸(VFA)浓度以外标法^[15]测定。使用安捷伦7890B型号气相色谱仪, 色谱条件为:火焰氢离子检测器温度220 ℃, 以氩气作为载气, 流速30 mL/min, 由氢气发生器提供氢气, 流速30 mL/min, 空气流速300 mL/min, 进样量2 μL。

氨态氮(NH₃-N)浓度利用靛酚比色法^[16]测定。主要测定步骤如下:在试管中加入0.05 mL样品, 边混合边加入2.5 mL苯酚溶液, 加入2.0 mL浓度为5.25%的次氯酸钠溶液并摇匀, 将试管置于95 ℃水浴5 min, 60 ℃水浴10 min, 取出冷却后使用天美UV-2600紫外分光光度计于630 nm下比色。

1.5 数据处理与统计分析

采用SPSS 20.0软件中全因子模型进行多因素方差分析和Duncan氏法多重比较检验。差异显著定义为P < 0.05。对组合效应估算值进行t检验, 其中方差分析中因子是壳聚糖分子质量和壳聚糖浓度, 水平分别为3种不同的分子质量和3种不同浓度。统计分析模型为:

式中:Y_ij表示观测值; μ表示所有观测值的平均值; α_i表示不同分子质量壳聚糖第i水平的处理效果(i=1, 2, 3);β_j表示不同浓度壳聚糖第j水平的处理效果(j=1, 2, 3);ε_ij表示随机误差。

2 结果与分析 2.1 壳聚糖对发酵液pH、NH₃-N浓度及干物质消化率的影响

由表 4可知, 除浓度为1.6%、分子质量为1 000 u的壳聚糖组, 其余壳聚糖组的发酵液pH均显著低于对照组(P < 0.05)。所有壳聚糖组NH₃-N的浓度均显著低于对照组(P < 0.05), 而且浓度为0.4%的壳聚糖组随着添加壳聚糖的分子质量的提高, NH₃-N浓度显著降低(P < 0.05)。所有壳聚糖组的干物质消化率与对照组均无显著差异(P>0.05)。

2.2 壳聚糖对体外产气量变化的影响

由表 5可知, 除浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组外, 其余壳聚糖组的总产气量显著高于对照组(P < 0.05), 浓度为0.8%的壳聚糖组和浓度为1.6%的壳聚糖组, 随着添加壳聚糖分子质量的提高, 总产气量显著下降(P < 0.05)。所有壳聚糖组产生氢气体积与对照组均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比, 所有壳聚糖组产生CH₄的体积均无显著差异(P>0.05), 其中分子质量为50 000 u的壳聚糖组产生CH₄的体积有降低趋势(0.05≤P < 0.10)。

2.3 壳聚糖对发酵液VFA浓度的影响

由表 6可知, 浓度为0.4%、分子质量为1 000 u的壳聚糖组总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度与对照组相比显著下降(P < 0.05), 其余各壳聚糖组与对照组差异均不显著(P>0.05)。浓度为0.4%的壳聚糖组的TVFA浓度随着添加壳聚糖分子质量的提高而显著升高(P < 0.05)。所有壳聚糖组的乙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸浓度与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。而壳聚糖组的丙酸浓度均显著高于对照组(P < 0.05), 且随着添加壳聚糖分子质量的提高, 浓度为0.4%、0.8%的壳聚糖组的丙酸浓度均显著升高(P < 0.05)。所有壳聚糖组的乙酸/丙酸与对照组相比均显著降低(P < 0.05), 各壳聚糖组之间差异不显著(P> 0.05)。

3 讨论 3.1 壳聚糖对发酵液pH、NH₃-N浓度及干物质消化率影响

本试验研究结果表明, 壳聚糖可以显著降低发酵液的pH, 但均在正常值范围之内。pH是衡量反刍动物瘤胃发酵的一个重要指标, 保持pH在一个正常的范围内是保证瘤胃正常发酵的前提^[17]。据报道, 在体外发酵系统中, 影响发酵液pH的主要因素是内碱性物质(如NH₃-N)和有机酸的产生^[18]。本试验中pH降低可能是由于NH₃-N的浓度显著降低造成的。瘤胃液中的NH₃-N浓度是瘤胃内环境参数的一个重要指标, 反映了瘤胃内微生物氮的供应状况。本研究发现, 壳聚糖可以显著降低瘤胃发酵液的NH₃-N浓度。与任海军^[19]和田雨佳等^[20]的研究结果有所不同。这可能是他们所选用的壳聚糖浓度及分子质量与本试验不同造成的。李朝云^[21]的研究结果与本试验结果相同, 即添加壳聚糖能够显著降低瘤胃液NH₃-N浓度。NH₃-N浓度的降低可能说明了瘤胃菌群结构有所变化。

3.2 壳聚糖对发酵液产气量、CH₄和H₂体积的影响

本试验中, 除浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组外, 其余壳聚糖组的总产气量显著高于对照组, 且不影响干物质消化率。有报道称, 体外培养时产气量越高, 说明饲粮在瘤胃内的发酵活动越剧烈^[22]。本研究发现添加壳聚糖有利于饲粮在瘤胃内的发酵。这与Goiri等^[23]的研究结果不同。这可能是由于所选择的壳聚糖不同造成的, 本试验所选择的小分子质量壳聚糖与3种浓度更有利于饲粮在瘤胃中的发酵。

本试验中, 浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组及浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组瘤胃发酵液的CH₄产量有降低趋势。根据瘤胃CH₄及VFA生成机制^[24], 在瘤胃内生成丙酸, 可以竞争性消耗氢气, 从而有效地抑制CH₄形成。虽然本研究结果显示生成氢气的体积无显著变化, 但氢气很可能处于一种动态平衡的状态。本试验研究结果表明, 添加壳聚糖能使丙酸浓度显著升高, 因此浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组及浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组CH₄体积有降低趋势的原因很可能是因为生成丙酸, 竞争性结合氢气导致的。

3.3 壳聚糖对发酵液VFA浓度的影响

VFA的主要作用是为动物生产提供能量以及维持瘤胃环境^[25]。根据本试验结果, 添加壳聚糖可显著提高瘤胃发酵液的丙酸浓度, 显著降低乙酸/丙酸, 虽然乙酸浓度没有显著变化, 但仍可以认为壳聚糖可以改变瘤胃发酵模式, 使瘤胃的发酵类型由乙酸型发酵向丙酸型发酵过渡, 这是目前饲料添加剂抑制反刍动物瘤胃CH₄生成的主要机理之一^[26]。

本试验结果显示, 壳聚糖可以使发酵液的丙酸浓度升高, 进而促使乙酸/丙酸降低, 改变瘤胃发酵模式, 推测与壳聚糖的抗菌作用密不可分。有报道称, 壳聚糖的主要抗菌作用模式是由于壳聚糖聚阳离子, 会吸引微生物表面上的负电荷, 从而引起细胞渗透性变化。这些静电相互作用, 促进微生物细胞壁中肽聚糖的水解, 并最终促使细胞裂解^[27]。由于肽聚糖层在革兰氏阳性细菌中比在革兰阴性细菌中更多, 因此, 壳聚糖的抗菌作用对革兰氏阳性细菌更为显著^[28]。壳聚糖对革兰氏阳性细菌的抗菌作用更明显, 瘤胃中主要发酵产物为乙酸的厚壁菌门就是革兰氏阳性菌, 而主要产物为丙酸的拟杆菌门和变形杆菌门都是革兰氏阴性细菌^[29]。从这个角度可以得出, 由于壳聚糖对革兰氏阳性细菌的抗菌作用, 导致了产乙酸菌的菌群丰度下降, 产丙酸菌的菌群丰度上升^[30], 从而进一步导致了发酵液各VFA浓度的改变, 最终使瘤胃发酵模式发生改变。但壳聚糖具体是如何作用于瘤胃菌群的, 还需要进一步的试验研究证明。本试验的研究结果与Belanche等^[30]以及任海军等^[31]的体外发酵研究结果基本一致。

本试验结果显示壳聚糖对体外发酵液的乙酸浓度无影响, 然而在Belanche等^[30]的研究结果中, 壳聚糖还能够使发酵液的乙酸浓度显著降低, 研究结果不同可能是由于所选壳聚糖分子质量不同, 本试验使用的3种不同分子质量的壳聚糖均属于低分子质量壳聚糖, 分子质量过小可能不足以使乙酸浓度降低。具体原因还需进一步验证。

此外, 本研究中, 浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组及浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组的添加效果最好。这2个组不但与其他组别一样显著提高了发酵液的丙酸浓度, 显著降低了乙酸/丙酸, 还能够使发酵液所生产的CH₄体积有降低趋势, 但是浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组有使干物质消化率下降的趋势, 因此, 浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖最为适宜。

4 结论

① 与对照组相比, 添加壳聚糖可以显著降低瘤胃发酵液NH₃-N浓度, 显著增加发酵液的丙酸浓度, 显著降低乙酸/丙酸, 促进瘤胃发酵模式的改变。

② 与对照组相比, 浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组及浓度为0.8%、分子质量为50 000 u的壳聚糖组发酵液CH₄体积有降低趋势。

③ 添加浓度为1.6%、分子质量为50 000 u的壳聚糖对瘤胃发酵参数的影响和抑制甲烷产生效果最为显著。