蛋鸡产蛋后期，因长时间保持旺盛的脂质代谢，产蛋性能下降，生理机能逐渐弱化，健康状态不容乐观。锌存在于所有的生物体中，调控机体多种代谢途径，参与机体的生长、发育、繁殖和免疫应答[1]；锌在蛋白质合成[2]、蛋白质沉积和蛋壳膜峡部沉积过程中起到了重要作用[3]；锌参与调节先天性免疫和适应性免疫反应，缺锌导致细胞介导的免疫功能障碍[4]，影响上皮细胞质量；在大鼠饲喂缺锌饲粮30 d后血浆瘦素含量、机体代谢率、酶活性显著降低[5]。
在生产中通常添加的无机锌以二价金属游离状态被吸收，这种添加方式易与植酸盐或木质素螯合降低锌的利用率。羟基蛋氨酸锌(MHA-Zn)是蛋氨酸羟基类似物与锌螯合成的一种有机锌，在动物生产中具有毒性低、化学性质稳定、适口性好及无刺激作用等优点[6]。研究表明，有机锌(例如氨基酸锌)通过氨基酸或小肽的方式被吸收，比无机锌利用率更高[7]，排放少，对环境造成的污染小。因此，用MHA-Zn替代无机锌可降低锌的添加水平。锌影响蛋和蛋壳品质，饲粮添加80 mg/kg锌可增加蛋壳强度[8]，过量添加则降低平均蛋重[9]；锌调控蛋壳结构，影响蛋壳的沉积和超微晶体结构[10]；低剂量的有机锌能够满足生产需要[11]；无机锌添加水平达到70 mg/kg时在生产中效果更好[12]。对于MHA-Zn替代无机锌在蛋鸡饲粮中的应用研究较少，且尚未研究不同锌源对免疫调控的分子机制。利用MHA-Zn部分或全部替代生产中常用的无机锌，可能对蛋鸡的生产性能、蛋品质和机体免疫功能达到相应效果。基于此，本试验进一步探讨饲粮中MHA-Zn的适宜添加水平及其对免疫相关基因表达的影响，旨在揭示其调控蛋鸡免疫的分子机制，为提高产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验锌源分别为硫酸锌(锌含量≥34.5%)和MHA-Zn(羟基蛋氨酸质量分数为80%，锌含量为12.1%，螯合率90%)，由上海诺伟司公司提供。
1.2 试验设计选取960只健康、产蛋性能基本一致的57周龄末海兰灰蛋鸡，采用单因子完全随机设计，随机分成4个组，每组8个重复，每个重复30只。参照NRC(1994)蛋鸡饲养标准，结合海兰公司推荐的饲粮营养水平，设计玉米-豆粕型基础饲粮(锌含量35.08 mg/kg)，基础饲粮组成及营养水平见表 1。预试期蛋鸡饲喂不补充锌的基础饲粮。正试期对照组在基础饲粮中添加80 mg/kg硫酸锌(以锌计)，试验组分别在基础饲粮中添加20、40和80 mg/kg MHA-Zn(以锌计)。试验期16周，其中预试期4周(57~60周龄)，正试期12周(61~72周龄)。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
饲养试验在陕西杨凌西北农林科技大学试验鸡场进行。3层阶梯式笼养，每笼2只鸡，有窗鸡舍。同一组的鸡均匀分布于鸡舍不同空间，自由采食、饮水，机械清粪，每天光照16 h。鸡舍温度18~29 ℃，相对湿度50%~70%。每天饲喂3次(08:00、11:00、16:00)，17:00收集鸡蛋。每天观察鸡群健康状况，记录死淘鸡数。常规免疫、消毒和饲养管理。
1.4 指标测定 1.4.1 生产性能正试期间，以重复为单位记录每天产蛋数、蛋重、喂料量、鸡只存栏数、破蛋数，每周称1次剩余料量，最后计算试验前期(61~64周龄)、试验中期(65~68周龄)和试验后期(69~72周龄)的产蛋率、日产蛋重、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。
1.4.2 蛋品质正试期第4、8和12周末，连续2 d，每重复随机选取3枚正常鸡蛋，测定蛋品质，蛋品质指标包括：蛋重、蛋白高度、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数、蛋黄颜色、哈夫单位、破蛋率。蛋壳厚度是在鸡蛋上取上、中、下3点，用蛋壳厚度测定仪(ETG-1601A，Robotmation公司，日本)测定取平均值，蛋壳强度由蛋壳强度测定仪(EFG-0503，Robotmation公司，日本)测定，蛋白高度、蛋黄颜色和哈夫单位采用蛋品质自动分析仪(EMT-5200，Robotmation公司，日本)测定。
1.4.3 脾脏中炎症免疫细胞因子相关基因表达试验期末(72周龄末)从每重复随机选取1只健康、体重接近平均体重的蛋鸡，采血后屠宰，分别取同部位的脾脏组织2 g左右，迅速剪成30~50 mg大小的组织块，放入冻存管置于液氮中速冻，-80 ℃保存待测。
采用Trizol试剂盒(TaKaRa)提取样品中的总RNA，经核酸浓度分析仪测定吸光度在260和280 nm处的比值在1.80~2.10，自动记录各浓度。琼脂糖凝胶电泳法检测其RNA质量。取RNA样品1 μg，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书，进行逆转录，合成cDNA。采用Primer 6.0软件设计引物，PCR引物序列见表 2。以cDNA为模板，采用荧光定量PCR技术检测脾脏中炎症免疫相关基因[核因子-κB1(NF-κB1)、细胞白介素-10(IL-10)、细胞白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]mRNA的相对表达量，应用Appiled Biosystems 7300 Real Time PCR System操作。20 μL反应体系包括：10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，2 μL cDNA，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL ROX Reference Dye，6 μL ddH2O。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。根据目的基因和内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的阈值循环(CT)，采用2-△△CT法计算样品中各目的基因mRNA的相对表达量。
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表 2 PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for PCR |
试验数据采用Excel 2013进行初步处理，用SPSS 21.0进行单因素方差分析，组间均值用Duncan氏法进行多重比较，数据均用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，各组之间蛋鸡的平均日采食量、产蛋率、料蛋比、日产蛋重和平均蛋重在试验前期、试验中期和试验后期均差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of MHA-Zn on performance of laying hens during later period of laying |
由表 4可知，各组之间鸡蛋的蛋黄颜色、哈夫单位和蛋白高度均差异不显著(P＞0.05)。40和80 mg/kg MHA-Zn组试验前期、试验中期和试验后期鸡蛋的蛋壳厚度和蛋壳强度均显著高于对照组和20 mg/kg MHA-Zn组(P＜0.05)。40、80 mg/kg MHA-Zn组试验前期、试验中期和试验后期鸡蛋的破蛋率均显著低于对照组和20 mg/kg MHA-Zn组(P＜0.05)。
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表 4 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of MHA-Zn on egg quality of laying hens during later period of laying |
由表 5可知，80 mg/kg MHA-Zn组脾脏IL-8 mRNA的相对表达量显著低于40 mg/kg MHA-Zn组(P < 0.05)，40 mg/kg MHA-Zn组显著低于20 mg/kg MHA-Zn组(P < 0.05)。各组之间脾脏TNF-α、IL-10和NF-κB1 mRNA的相对表达量均差异不显著(P>0.05)。
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表 5 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡脾脏免疫相关基因mRNA相对表达量的影响 Table 5 Effects of MHA-Zn on mRNA relative expression levels of immune-related genes in spleen of laying hens during later period of laying |
锌是机体重要的微量元素，参与机体多种酶的合成。研究表明，饲粮中添加不同水平的锌能够提高肉鸡的生产性能和肉品质[13]，这可能是由于锌对于维持金属蛋白的结构有着至关重要的作用，缺锌会影响肉鸡的蛋白质代谢[14]。研究表明，有机锌的利用率高于无机锌，在饲粮中添加蛋氨酸锌能够显著提高蛋鸡的生产性能、蛋品质和免疫机能[15]。薛颖等[16]研究表明，以有机形式添加复合微量元素时可以显著提高产蛋率，降低料蛋比。基础饲粮中添加70、140 mg/kg蛋氨酸锌能够显著提高日产蛋重和产蛋率，降低料蛋比[17]。本试验结果表明，饲粮添加不同水平的MHA-Zn对蛋鸡产蛋后期平均日采食量、料蛋比、平均蛋重、产蛋率和日产蛋重均无显著影响。这与前人的研究结果不一致，可能是由于本试验中基础饲粮中锌含量为35.08 mg/kg，已经达到蛋鸡生长与生产的需要量，在基础饲粮上再添加锌，部分生产性能并不会随着饲粮锌添加水平的增加而提高。同时，饲粮中铜、锰、铁含量为固定值，添加高水平的锌会因元素间拮抗的作用而影响吸收利用。
3.2 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响蛋壳破损是鸡蛋被淘汰的主要原因之一。微量元素的催化特性作为关键酶参与蛋壳膜和蛋壳的形成过程。锌是碳酸酐酶的重要组分，碳酸酐酶在蛋壳形成过程中提供重要的碳酸盐离子(HCO3-)，碳酸盐沉积会增加蛋壳重量。缺锌会导致HCO3-减少，大大降低蛋壳厚度，影响蛋壳重量[10]。有研究表明，在不同的饲粮锌水平下，蛋壳厚度没有显著差异时蛋壳强度存在显著差异[18]，这说明蛋壳的强度可能与蛋壳的结构关系更密切。锌能够影响蛋白质的合成，在蛋壳的形成的过程中可能影响蛋壳膜的结构[3]。微量元素对蛋壳沉积过程中超微晶体的排布也有显著影响，饲粮添加高水平锌能够提高蛋壳强度和蛋壳厚度，降低破蛋率[19]。也有研究结果表明，有机微量元素的吸收率高于无机微量元素，有机锌、锰添加组相比无机锌、锰对照组蛋壳厚度和强度显著增加，破蛋率显著降低[18]。本试验结果与前人研究结果一致，饲粮MHA-Zn添加水平为40和80 mg/kg时与饲粮添加80 mg/kg的硫酸锌相比能够显著提高蛋壳重量和蛋壳强度，显著降低破蛋率。这些指标并没有随着有机锌的添加水平的增加而显著变化，而40和80 mg/kg MHA-Zn组之间没有显著差异，这也与上述研究结果一致，当锌的添加水平达到一定水平后，继续添加锌对蛋壳厚度、强度等指标不会有持续增加效果。饲粮添加40 mg/kg的MHA-Zn就可以达到生产中饲粮添加80 mg/kg硫酸锌的效果。
3.3 MHA-Zn对产蛋后期蛋鸡脾脏免疫相关基因表达的影响锌缺乏会影响机体免疫功能[5]。越来越多的文献表明，锌作为炎症免疫信号通路核因子-κB(NF-κB)信号的负调控因子，影响炎症细胞因子的表达[20]。在机体锌缺乏时会使促炎性细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和TNF-α的表达上调[21]。NF-κB1是一种介导促炎反应的高度保守的核转录因子，研究发现NF-κB1与细胞凋亡的关系也相当密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控，具有抑制和促进细胞凋亡的双向作用。IL-8是免疫趋化因子，主要调节体内造血细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、神经细胞等多种细胞的增殖和分化，可导致机体局部炎症反应[22]。IL-10作用于多种免疫细胞，抑制白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、白细胞介素-12(IL-12)和TNF-α等促炎细胞因子[23]。在肉鸡试验中，通过对种鸡和子代肉鸡提供低高剂量有机锌，可显著降低促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA的相对表达量，而低剂量有机锌组结果则相反；同时种鸡词喂高剂量无机锌组的子代肉鸡空肠的IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA的相对表达量显著低于种鸡词喂正常剂量有机锌组[24]。在人体内补充锌能够通过结合锌指蛋白A20，抑制NF-κB活化来降低IL-1β和TNF-α mRNA的相对表达量，从而下调炎症细胞因子[16]。饲粮添加有机锌能够提高动物的抗氧化能力，在之前的研究中发现，饲粮添加MHA-Zn能够显著提高蛋鸡血清和肝脏中的总抗氧化能力[11]。
本试验中，与20 mg/kgMHA-Zn组相比，80 mg/kg MHA-Zn组促炎细胞因子IL-8 mRNA的相对表达量显著降低，这与李昌武[24]的研究结果一致，李昌武[24]研究表明，在添加低剂量锌的饲粮条件下，促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA的相对表达量显著上调。本试验中，饲粮添加不同水平的MHA-Zn对脾脏NF-κB1、TNF-α和IL-10 mRNA的相对表达量均无显著影响。这可能是由于试验动物年龄与生理状态的差异，蛋鸡产蛋后期各项生理机能都处于较低水平，也可能由于微量元素之间的互作效应，短期锌营养的变化可能影响其他微量元素的吸收。
4 结论饲粮添加40和80 mg/kg MHA-Zn可显著提高蛋壳厚度和蛋壳强度，显著降低破蛋率，显著降低脾脏促炎因子IL-8 mRNA的相对表达量。建议产蛋后期蛋鸡饲粮中MHA-Zn的适宜添加水平为40 mg/kg。
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