近年来，随着我国奶牛养殖规模的不断扩大，对大豆等蛋白质饲料的需要量不断增加，在集约化的养殖模式下，大量未被利用的氮元素经奶牛的粪尿直接排放到外界环境中，既造成了蛋白质资源的浪费，又加剧了环境的污染，蛋白质饲料原料短缺和环境污染等因素成为制约我国奶牛养殖业发展的重要因素。实际生产中，在不影响奶牛产奶性能的前提下，提高奶牛对饲粮蛋白质的利用率、降低氮排泄量，对减少因奶牛养殖对环境造成的污染具有重要的意义。在反刍动物蛋白质营养中，限制性氨基酸及饲粮氨基酸组成模式是决定动物体内含氮物质利用效率的重要因素^[1]。赖氨酸作为反刍动物的第一或第二限制性氨基酸，有研究发现，将其进行过瘤胃处理后添加到反刍动物饲粮中可以避免赖氨酸在瘤胃中的降解，增加小肠内赖氨酸的含量，提高饲粮蛋白质的利用率^[2]。王星凌等^[3]研究饲粮蛋白质和赖氨酸对奶牛生产性能和氮排泄的影响时发现，饲粮中添加过瘤胃赖氨酸(RPLys)可显著提高奶牛产奶量和乳蛋白率，并可提高氮的利用率。RPLys可以满足奶牛对限制性氨基酸的需要，增加小肠可利用氨基酸的数量，提高奶牛的产奶性能。欧阳靖^[4]在研究饲粮赖氨酸对羔羊消化代谢的影响时发现，赖氨酸可以提高羔羊对有机物的消化量，增加氮的沉积，提高氮的利用率。刘钢等^[5]研究发现，在奶牛的饲粮中添加RPLys可以平衡奶牛机体氨基酸的利用体系，促进蛋白质的消化吸收，提高饲料蛋白质的利用率和奶牛的产奶量，减少氮排泄量。蛋白质营养的实质是氨基酸营养，蛋白质消化率的变化间接反映氨基酸消化率的变化^[6]，RPLys在反刍动物中的研究主要集中于产奶性能方面，而在饲粮中添加RPLys对奶牛瘤胃微生物蛋白(MCP)产量以及氮排泄影响的研究极为鲜见。本试验通过在奶牛饲粮中添加不同水平的RPLys，探讨其对瘤胃MCP产量、产奶性能和氮排泄的影响，确定RPLys在奶牛饲粮中的最适添加量，以期提高奶牛产奶性能、饲粮蛋白质利用率和瘤胃MCP产量，减少氮排泄，改善养殖环境，为我国奶牛养殖业的健康可持续发展提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

本试验所用RPLys(过瘤胃率为70%)由青岛润博特生物科技有限公司提供，为白色颗粒状物质，组成原料为L-赖氨酸盐酸盐、棕榈油、二氧化硅，其中赖氨酸含量≥50%，水分含量≤12%。试验采用单因素随机分组的方法，选取烟台荷牧园牧业有限责任公司养殖的年龄、体重、胎次、产奶量、乳成分及泌乳期[(90±15) d]相近且体况良好的荷斯坦奶牛40头，随机分为4组，每组10头。对照组、试验1组、试验2组和试验3组饲粮中分别添加0、25、30和35 g/(d·头)RPLys。每头奶牛每天从饲粮中预留出0.5 kg麸皮，将RPLys与预留的0.5 kg麸皮混合均匀后均分为2份，每日分2次随全混合日粮(TMR)饲喂。TMR组成及营养水平见表 1。

1.2 饲养管理

试验牛采用分栏饲喂，整个试验期共75 d，其中预试期15 d，正试期60 d。试验牛每日使用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶3次(04:00、12:00、18:00)，每日饲喂TMR 2次(04:30、18:30)，确保奶牛每日有20 h以上时间能够接触到TMR。试验奶牛采食后，在运动场自由运动和饮水，按常规对试验牛进行驱虫、光照及管理。

1.3 样品的采集与处理 1.3.1 TMR样

在预试期第1~3天、正试期第28~30天和第58~60天时采用四分法收集3次TMR样，将收集的TMR样置于65 ℃恒温干燥箱中烘干，制成风干样，粉碎混匀后备用。

1.3.2 尿样

分别在预试期第1~3天、正试期第28~30天和第58~60天时收集尿样，参照朱雯^[6]介绍的点收尿法，采取人工接尿结合膀胱取尿的方法，每天收集2次，每隔12 h收集1次，连续收集3 d，每天在前1天的基础上延后4 h收集。向每次收集的尿样中加入10%的硫酸，调整pH(使pH<3)后，于-20 ℃冰柜中冷冻保存。

1.3.3 粪样

分别在预试期第1~3天、正试期第28~30天和第58~60天收集3次粪样，每次连续3 d进行24 h全收粪。每次收集粪样前将试验牛的牛床冲洗干净，及时将试验牛粪便收集入桶，将每天收集的粪样混合均匀并称重，采用四分法收集当天粪便，按每100 g粪样加入25 mL硫酸(10%)的方式进行固氮处理后，于-20 ℃冰柜中进行冷冻保存。每阶段采样结束后，将3 d所收集的粪样按样重比例混匀，置于恒温干燥箱中65 ℃烘至恒重，制成风干样进行保存。

1.3.4 乳样

分别在预试期第1天和正试期每隔15 d，按照早、中、晚4 : 3 : 3的比例收集乳样50 mL于取样瓶中，加入30 mg重铬酸钾防腐剂，混匀后将其放于4 ℃冰柜中冷藏保存，用于乳成分各项指标的测定。

1.4 指标测定与方法 1.4.1 采食量

试验牛分栏饲喂，单独记录每头试验牛的采食量。预试期内，每隔2 d记录1次投料量，每次饲喂前收集剩余饲粮并称重，依据投料量和剩料量计算出每头牛的采食量。采用相同的方法，正试期内每隔10 d记录并计算1次采食量，总共记录6次，每次连续记录3 d，根据3 d的采食量记录计算出该阶段的平均采食量。每次根据上一阶段测定的平均采食量调整下一阶段TMR饲喂量。

1.4.2 常规营养物质含量

参照GB/T 6435—2006^[8]测定水分含量，计算干物质(DM)含量；粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994^[9])进行测定；参照GB/T 20806—2006^[10]测定中性洗涤纤维(NDF)含量；参照NY/T 1459—2007^[11]测定酸性洗涤纤维(ADF)含量；钙(Ca)含量的测定采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002^[12])；磷(P)含量的测定采用分光光度法(GB/T 6437—2002^[13])。

1.4.3 瘤胃MCP产量

尿中排出的嘌呤衍生物(PD)主要来源于瘤胃微生物嘌呤，因此通过测定尿中PD的含量可以估测出瘤胃MCP产量。尿中尿酸和尿囊素的含量使用比色法进行测定，尿酸和尿囊素含量之和即为尿PD含量^[14]。测定尿酸含量时使用仪器为UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，测定尿囊素含量时使用的仪器为DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)。

小肠吸收外源性嘌呤量(X)的计算公式为：

式中：Y为尿中PD排出量(mmol/d)；0.85为牛肠道吸收的嘌呤转化为尿中PD的回收率；0.385为当牛肠道吸收嘌呤的量为0时，尿中内源PD的排出量；BW^0.75为动物的代谢体重(kg)。

瘤胃MCP产量的计算公式为：

式中：X为小肠吸收外源性嘌呤量(mmol/d)；70为每摩尔嘌呤的含氮量(mg/mol)；0.83为微生物核酸嘌呤的消化率；0.116为瘤胃微生物总氮中嘌呤氮的比例；6.25为氮换算为蛋白质的平均系数。

1.4.4 产奶量及乳成分

采用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶，挤奶时自动显示产奶量。在预试期和正试期期间，每隔5 d记录1次试验牛产奶量，每次连续记录3 d，取3 d产奶量的平均值。

采用山东省农业科学院奶牛研究中心生产性能测定实验室的乳成分和体细胞自动分析仪(Combi Foss FT+, 丹麦Foss公司，)测定乳样中的乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和乳体细胞数，计算正试期内各乳成分指标的平均值。

1.4.5 氮代谢指标

利用脲酶法测定尿中尿素氮含量^[15]，利用苦味酸比色法测定尿肌酐含量^[16]，以上测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。参考Valadares等^[16]的试验方法，通过尿肌酐(每天每头牛1 kg体重大约排出29 mg尿肌酐)标记来测定试验牛的排尿量。试验测定尿素氮、尿肌酐含量时，使用仪器为UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

氮代谢指标计算公式如下：

1.5 数据处理与分析

使用Excel 2010软件对试验数据进行初步处理，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，采样Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，以P < 0.05和P < 0.01分别表示差异显著和极显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析 2.1 RPLys添加量对奶牛瘤胃MCP产量的影响

由表 2可知，在尿酸排出量方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，且30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)，与35 g/(d·头)RPLys添加组之间差异不显著(P>0.05)；在尿囊素排出量方面，30和35 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于对照组(P < 0.01)，25 g/(d·头)RPLys添加组与对照组无显著差异(P>0.05)，30 g/(d·头)RPLys添加组还极显著高于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)；在尿PD排出量方面，25 g/(d·头)RPLys添加组显著高于对照组(P < 0.05)，30和35 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于对照组(P < 0.01)，30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)，与35 g/(d·头)RPLys添加组之间差异不显著(P>0.05)；在瘤胃MCP产量方面，25 g/(d·头)RPLys添加组显著高于对照组(P < 0.05)，30和35 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于对照组(P < 0.01)，30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)，与35 g/(d·头)RPLys添加组之间无显著差异(P>0.05)，25、30、35 g/(d·头)RPLys添加组的瘤胃MCP产量分别比对照组提高了5.34%、14.76%、10.06%。

2.2 RPLys添加量对奶牛干物质采食量和产奶性能的影响

由表 3可知，各试验组的干物质采食量与对照相比均差异不显著(P>0.05)。正试期内，在产奶量方面，25和35 g/(d·头)RPLys添加组显著高于对照组(P < 0.05)，30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于对照组(P < 0.01)，25、30、35 g/(d·头)RPLys添加组的产奶量分别比对照组提高了5.34%、9.30%、6.69%；在乳蛋白率方面，30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于对照组(P < 0.01)，35 g/(d·头)RPLys添加组显著高于对照组(P < 0.05)，25 g/(d·头)RPLys添加组与对照组相比无显著差异(P>0.05)；在乳脂率、乳糖率和乳体细胞数方面，各试验组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

2.3 RPLys添加量对奶牛氮排泄及氮表观消化率的影响

由表 4可知，各试验组的食入氮与对照组相比均无显著差异(P>0.05)；各试验组粪氮、尿氮排出量均极显著低于对照组(P < 0.01)，其中30 g/(d·头)RPLys添加组尿氮排出量极显著低于25 g/(d·头)RPLys添加组；在乳氮排出量方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，其中30 g/(d·头)RPLys添加组极显著高于25和35 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)；在可消化氮方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)，其中30 g/(d·头)RPLys添加组显著高于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.05)，与35 g/(d·头)RPLys添加组之间差异不显著(P>0.05)；在氮总排出量方面，各试验组均极显著低于对照组(P < 0.01)，其中30 g/(d·头)RPLys添加组极显著低于25 g/(d·头)RPLys添加组(P < 0.01)，25、30、35 g/(d·头)RPLys添加组的氮总排出量分别比对照组降低了5.70%(P < 0.01)、9.98%(P < 0.01)、7.87%(P < 0.01)；各试验组的氮沉积均极显著高于对照组(P < 0.01)；在氮表观消化率方面，各试验组均极显著高于对照组(P < 0.01)。

3 讨论 3.1 RPLys添加量对奶牛瘤胃MCP产量的影响

尿中PD的含量与瘤胃MCP产量存在高度相关性^[17]，由于尿中排出的PD主要来源于瘤胃微生物嘌呤，因此通过测定尿中PD的含量可以估测出奶牛瘤胃MCP产量。本试验条件下，在奶牛饲粮中添加不同水平RPLys后显著或极显著提高了奶牛瘤胃MCP产量。刘文杰^[18]研究赖氨酸对小尾寒羊瘤胃和整体消化代谢的影响时指出，添加赖氨酸可以提高瘤胃液中总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度，增加瘤胃液中细菌总数，同时提高了绵羊对有机物和粗蛋白质的表观消化率，改善瘤胃发酵类型，促进瘤胃消化代谢能力，提高瘤胃MCP产量。黄健^[6]研究饲粮中添加赖氨酸对梅花鹿生长性能和消化代谢的影响时发现，赖氨酸能增加尿囊素和PD排出量，间接促进瘤胃MCP产量的增加。林英庭等^[19]研究瘤胃保护性赖氨酸对小尾寒羊瘤胃发酵的影响时发现，在绵羊的饲粮中添加瘤胃保护性赖氨酸可以显著提高瘤胃MCP产量，瘤胃液NH₃-N浓度变化反映了瘤胃微生物对饲粮氮的降解速度和瘤胃微生物对氨态氮(NH₃-N)的利用速度，瘤胃液NH₃-N浓度间接影响MCP产量。在奶牛饲粮中添加RPLys后，通过改善瘤胃发酵类型，促使瘤胃MCP合成的速率大于瘤胃微生物分解蛋白质生成NH₃-N的速率，提高了奶牛瘤胃MCP产量。本试验中，随着RPLys添加量的增加，瘤胃MCP产量呈先增加后降低的变化趋势，其中RPLys添加量为30 g/(d·头)时增加效果最明显。因为氨基酸之间存在拮抗作用^[20]，添加高剂量的赖氨酸后，可能干扰了其他氨基酸的吸收和代谢，从而导致瘤胃MCP产量不再增加。

3.2 RPLys添加量对奶牛干物质采食量和产奶性能的影响

Robinson等^[21]研究发现，在泌乳奶牛的饲粮中添加RPLys对干物质采食量无显著影响。韩云胜等^[22]研究发现，在饲粮中添加RPLys对荷斯坦奶牛的干物质采食量无显著影响。在本试验条件下，奶牛饲粮中添加RPLys对荷斯坦奶牛的干物质采食量无显著影响，与上述研究结果一致。云伏雨^[23]在奶牛饲粮中补饲瘤胃保护性赖氨酸后发现其对奶牛干物质采食量无显著影响，但显著提高了奶牛的产奶量和乳蛋白含量。RPLys的使用可以满足泌乳奶牛对限制性氨基酸的需要，增加小肠可利用氨基酸的数量，进而提高泌乳奶牛的生产性能。Giallongo等^[24]向奶牛灌注RPLys后发现，RPLys可提高奶牛产奶量，促进乳蛋白合成，提高乳蛋白率。刘钢等^[5]研究表明，在奶牛饲粮中添加RPLys可以降低奶牛对过瘤胃蛋白质的需要量，满足奶牛对限制性氨基酸的需要量，提高奶牛的产奶量和乳蛋白率。唐庆凤等^[25]研究发现，在泌乳水牛饲粮中添加RPLys能够显著提高水牛的乳蛋白率。Giallongo等^[26]在研究过瘤胃赖氨酸对奶牛生产性能的影响时指出，RPLys可以提高奶牛的产奶量和乳蛋白率。奶牛饲粮中的小肠可消化蛋白质(IDCP)是合成乳蛋白的来源^[27]，在奶牛饲粮中添加RPLys后可提高IDCP的总量，并改善了IDCP中可消化氨基酸的组成比例，从而提高了奶牛乳蛋白的含量。本试验条件下，饲粮中添加RPLys后显著提高了奶牛的乳蛋白率，可能是添加RPLys后改善了小肠内氨基酸的组成，提高了奶牛对蛋白质的利用率，进而提高了奶牛的乳蛋白率。本试验中，随着RPLys添加量的增加，试验牛产奶量和乳蛋白率呈先升高后降低的变化趋势，其中RPLys添加量为30 g/(d·头)时提高效果最明显；乳脂率、乳糖率和乳体细胞数的变化趋势并不明显。饲喂高剂量的RPLys引起奶牛产奶量和乳蛋白率降低的原因，可能是由于高剂量赖氨酸与其他氨基酸之间产生了拮抗作用，影响了其他氨基酸的消化和吸收^[20]，降低了饲粮蛋白质的利用率，从而造成了试验牛产奶量和乳蛋白率的降低。

3.3 RPLys添加量对奶牛氮排泄及氮表观消化率的影响

氮消化代谢反映了饲粮蛋白质沉积效率和氨基酸平衡状况，也与动物的生产性能密切相关，饲粮中添加RPLys可以提高动物对蛋白质的消化吸收，提高蛋白质的利用率，降低氮排泄^[28]。氨作为饲粮蛋白质降解的产物，更是瘤胃微生物生长所需的主要氮源。毛成文^[29]研究饲粮赖氨酸水平对獭兔生长性能和氮排泄的影响时指出，赖氨酸能降低血浆中尿素氮的含量，提高机体对蛋白质的消化吸收能力，提高氮沉积率。在本试验条件下，奶牛采食含有RPLys的饲粮后，粪氮、尿氮排出量和氮总排出量均极显著降低，可消化氮和氮表观消化率均显著提高。Socha等^[30]研究发现，在奶牛饲粮中添加RPLys可以降低尿中尿氮的浓度，提高氮的转化率，提高蛋白质的利用率，减少氮排出量。方桂友等^[31]在研究赖氨酸对泌乳母猪生产性能和氮排泄的影响中发现，赖氨酸可以降低母猪尿素氮的浓度，显著减少粪氮排出量，提高氮表观消化率。李雪玲等^[32]研究RPLys对断奶羔羊生长指标及氮利用率的影响时指出，饲粮中添加RPLys可以提高饲粮蛋白质转化效率、氮沉积和氮表观消化率。Whelan等^[33]研究发现，在奶牛饲粮中添加赖氨酸可以改善氨基酸平衡，减少尿氮排放，提高氮的利用率。饲粮中添加RPLys可以增加小肠可消化氨基酸总量，减少蛋白质在瘤胃内转化过程中的损失，进一步提高饲粮蛋白质的利用率，减少氮的排出量。奶牛瘤胃内氮代谢与MCP产量息息相关，奶牛饲粮中添加RPLys有助于改善瘤胃消化代谢能力，使瘤胃MCP合成的速率大于瘤胃微生物分解蛋白质生成NH₃-N的速率，提高奶牛瘤胃MCP产量，减少NH₃-N的损失，提高氮的利用率，降低氮总排出量。本试验中，随着RPLys添加量的增加，试验牛氮总排出量呈先降低后升高的变化趋势，其中RPLys添加量为30 g/(d·头)时提高效果最明显。添加高添加量的RPLys造成奶牛氮总排出量升高的原因，可能是因为赖氨酸与精氨酸之间产生了拮抗作用，赖氨酸与精氨酸的膜转运载体相同，当赖氨酸添加量较高时，影响了精氨酸的吸收，增加了肾脏中精氨酸的降解，提高了尿中精氨酸和尿素的排出量，增加了尿氮的排出量^[27]，从而导致高添加量组[30 g/(d·头)RPLys组]氮总排出量相对升高。

4 结论

饲粮中添加RPLys可以提高奶牛瘤胃MCP产量和产奶性能，降低奶牛氮排泄。综合考虑以上各个指标，在本试验条件下，奶牛饲粮中RPLys的最适添加量为30 g/(d·头)。