体外产气法研究植物精油对肉羊体外瘤胃发酵参数及甲烷产量的影响

引用本文

石宁, 贾淼, 李艳玲. 体外产气法研究植物精油对肉羊体外瘤胃发酵参数及甲烷产量的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(1): 274-284.

SHI Ning, JIA Miao, LI Yanling. Effects of Plant Essential Oil on Rumen Fermentation Parameters and Methane Production of Mutton Sheep in Vitro[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(1): 274-284.

体外产气法研究植物精油对肉羊体外瘤胃发酵参数及甲烷产量的影响

石宁, 贾淼, 李艳玲

北京农学院动物科学技术学院, 奶牛营养学北京市重点实验室, 北京 102206

收稿日期: 2018-06-13

基金项目: 国家自然科学基金项目（31302000）；北京市农业科技项目（20170131）

作者简介: 石宁(1987-), 男, 河北石家庄人, 硕士研究生, 研究方向为反刍动物营养与饲料科学。E-mail:522583272@qq.com

通信作者: 李艳玲, 副教授, 硕士生导师, E-mail:yanl_li@163.com.

摘要: 本试验旨在采用体外产气法研究4种天然植物精油（桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油）对肉羊体外瘤胃发酵参数及甲烷（CH₄）产量的影响。体外培养底物精粗比为60：40，分别添加0（对照）、50、100、200和400 mg/L的桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油，每种植物精油的每个浓度设置3个重复，体外模拟瘤胃发酵培养24 h，测定24 h产气量和气体中的CH₄产量以及瘤胃发酵液的pH、挥发性脂肪酸（VFA）和氨态氮（NH₃-N）浓度。结果表明：1）添加山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液pH（P < 0.05）。2）与对照组相比，添加400 mg/L山苍子油、茴香油显著降低了总VFA浓度（P < 0.05），且随着山苍子油、茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势（P < 0.05）；添加400 mg/L山苍子油和茴香油均显著增加了乙酸比例（P < 0.05），且随着山苍子油和茴香油添加浓度的增加呈先降低后升高的二次曲线趋势（P < 0.05）；添加200 mg/L茴香油、400 mg/L桉叶油显著提高了丙酸比例（P < 0.05），而添加400 mg/L的山苍子油显著降低了丙酸比例（P < 0.05），且随着桉叶油、山苍子油、茴香油添加浓度的增加呈二次曲线变化趋势（P < 0.05）；添加400 mg/L桉叶油、200 mg/L茴香油显著降低了乙酸/丙酸（P < 0.05），添加400 mg/L山苍子油显著增加了乙酸/丙酸（P < 0.05），且随着桉叶油、山苍子油、茴香油添加浓度的增加呈二次曲线变化趋势（P < 0.05）。3）与对照组相比，添加400 mg/L茴香油显著降低了NH₃-N含量（P < 0.05），且随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势（P < 0.05）。4）与对照组相比，添加400 mg/L山苍子油、茴香油均显著降低了产气量（P < 0.05），且随则山苍子油添加浓度的增加呈先增加后降低的二次曲线趋势（P < 0.05），随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势（P < 0.05）；添加400 mg/L山苍子油、茴香油显著降低了CH₄产量（P < 0.05），且随着山苍子油添加浓度的增加呈先增加后降低的二次曲线趋势（P < 0.05），随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势（P < 0.05）。由此可见，不同植物精油对体外瘤胃发酵参数和CH₄产量的影响结果不同，且与植物精油浓度有关。

关键词: 植物精油瘤胃发酵参数甲烷产量

Effects of Plant Essential Oil on Rumen Fermentation Parameters and Methane Production of Mutton Sheep in Vitro

SHI Ning, JIA Miao, LI Yanling

Animal Science and Technology College, Beijing University of Agricultural, Beijing Key Laboratory of Dairy Cow Nutrition, Beijing 102206, China

Corresponding author: LI Yanling, associate professor, E-mail:yanl_li@163.com.

Abstract: The objective of this experiment was to study the effects of four kinds of plant essential oils (eucalyptus oil, litsea cubeba oil, cinnamon oil and anise oil)on rumen fermentation parameters and methane (CH₄) production of mutton sheep in vitro. The ratio of concentrate to forage of the cultivation substrates was 60:40, and 0 (control), 50, 100, 200 and 400 mg/L of eucalyptus oil, litsea cubeba oil, cinnamon oil or anise oil were added, respectively. There were 3 replicates for each concentration of four plant essential oils. The 24 h gas production, CH₄ proportion in gas, pH, volatile fatty acid (VFA) and ammonia nitrogen (NH₃-N) concentrations were measured for 24 h simulating rumen fermentation cultivation in vitro. The results showed as follows:1) adding litsea cubeba oil and anise oil significantly affected the rumen fermentation fluid pH in vitro (P < 0.05). 2) Compared with the control group, adding 400 mg/L litsea cubeba oil and anise oil significantly decreased the total VFA concentration (P < 0.05), and showed a linearly decreased trend with the concentrations of litsea cubeba oil and anise oil increased (P < 0.05); adding 400 mg/L litsea cubeba oil and anise oil significantly increased the acetic acid proportion (P < 0.05), and showed a firstly decreased and then increased quadratically trend with the concentration of litsea cubeba oil and anise oil increased (P < 0.05); adding 200 mg/L anise oil and 400 mg/L eucalyptus oil significantly increased the propionic acid proportion (P < 0.05), adding 400 mg/L litsea cubeba oil significantly decreased the propionic acid proportion (P < 0.05), and showed a quadratic curve change trend with the concentrations of eucalyptus oil, litsea cubeba oil and anise oil increased (P < 0.05); adding 400 mg/L eucalyptus oil and 200 mg/L anise oil significantly decreased the ratio of acetic acid to propionic acid (P < 0.05), adding 400 mg/L litsea cubeba oil significantly increased the ratio of acetic acid to propionic acid (P < 0.05), and showed a quadratic curve change trend with the concentrations of eucalyptus oil, anise oil and litsea cubeba oil increased (P < 0.05). 3) Compared with the control group, adding 400 mg/L litsea cubeba oil and anise oil significantly decreased the NH₃-N concentration (P < 0.05), and showed a linearly decreased trend with the concentration of anise oil increased (P < 0.05). 4) Compared with the control group, adding 400 mg/L litsea cubeba oil and anise oil significantly decreased the gas production (P < 0.05), and showed a firstly increased and then decreased quadratically trend with the concentration of litsea cubeba oil increased (P < 0.05), and showed a linearly decreased trend with the concentration of anise oil increased (P < 0.05); adding 400 mg/L litsea cubeba oil and anise oil significantly decreased the CH₄ production (P < 0.05), and showed a firstly increased and then decreased quadratically trend with the with the concentration increase of litsea cubeba oil increased (P < 0.05), and showed a linearly decreased trend with the concentration of anise oil increased. (P < 0.05). The results indicate that different plant essential oils have different effects on rumen fermentation parameters and CH₄ production in vitro, and which are related to the concentration of essential oils.

Key words: plant essential oil rumen fermentation parameters methane production

气候变化与二氧化碳(CO₂)和甲烷(CH₄)等温室气体的排放有着密切的关系。虽然CH₄的排放水平远远低于CO₂，但是CH₄比CO₂活跃得多^[1]。CH₄排放主要源于能源生产或其他工业活动，然而，人为CH₄排放量的贡献最大，占全球CH₄排放量的26%，主要是由于牛、羊和骆驼等反刍动物产生的CH₄引起^[2]。因此，人类对乳制品、牛羊肉的消费，在很大程度上对全球温室气体产生造成很大影响^[3]；此外，反刍动物消化碳水化合物及氨基酸时，由于CH₄排放造成摄入能量损失2%~15%，且随摄入量和饲粮组成的不同而变化^[4]。瘤胃发酵生成CH₄不仅对环境造成影响，同时也对饲料能量造成严重浪费。因此，研究降低瘤胃CH₄排放对保护环境和提高反刍动物生产效率具有双重意义。

虽然许多抗生素离子载体等已经成功地用于降低反刍动物瘤胃中CH₄产量以及能量的损失，但是抗生素在乳和肉中残留及其对人类健康影响的风险，使广大科研工作者越来越倾向于选择天然的绿色添加剂^[5]。植物精油(essential oils)是一类存在于天然植物中可随水蒸气蒸馏出来但又不溶于水的挥发性油状物质的总称。饲粮中添加植物提精油可影响瘤胃发酵和CH₄产量，导致脱氨和CH₄生成的抑制，产生较低浓度的氨态氮(NH₃-N)、CH₄和乙酸以及较高浓度的丙酸和丁酸等^[6-10]，然而研究发现不同植物精油对瘤胃发酵的影响也不尽相同^[11]。因此，本试验利用我国产量居世界首位的桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油开展肉羊体外瘤胃发酵试验，研究其对体外瘤胃发酵参数和CH₄产量的影响，为植物精油在反刍动物生产上的应用提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 植物精油

选择4种天然植物精油开展本试验，分别是桉叶油(纯度80%，广西)、山苍子油(纯度70%，南京)、茴香油(纯度89%，广西)、肉桂油(纯度80%，广西)。

1.2 试验设计

瘤胃体外培养试验的底物参考我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)推荐的营养水平，以玉米、豆粕和羊草等作为原料，粉碎过0.5 mm筛，按一定比例配制，底物组成及营养水平见表 1，底物精粗比为60 : 40。试验采用单因子试验设计，在底物中分别添加不同浓度的植物精油，使发酵液中4种植物精油(桉叶油、山苍子油、茴香油和肉桂油)的浓度分别为0(对照)、50、100、200和400 mg/L。每种植物精油的每个剂量设3个重复。另设1个空白对照组(用于校正产气量值)，该组也设3个重复。

表 1 底物组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the substrate (DM basis)

1.3 体外瘤胃发酵培养

瘤胃体外产气试验采用Menke等^[12]的体外产气法，选用4只体重(67.0±1.2) kg、健康且装有永久瘤胃瘘管的杜×寒F1代杂交成年羊作为瘤胃液供体羊。瘤胃液与缓冲液以1 : 2的比例混合制成人工瘤胃发酵液。称取200 mg(干物质基础)底物至100 mL培养管(注射器)的顶部，在加入人工瘤胃发酵液之前，从培养管的前端注入0.5 mL植物精油混合物(植物精油与乙醇不同浓度梯度的混合物)，然后加入30 mL人工瘤胃发酵液。按照试验设计，使得加入发酵液后4种植物精油浓度都分别达到0、50、100、200和400 mg/L。另外，空白对照组的培养管中不加底物，直接加入30 mL人工瘤胃发酵液。各培养管放置在39 ℃的恒温水浴培养箱中培养24 h，记录培养管在不同时间点的刻度值，并于24 h终止培养，测定发酵液各项发酵参数和CH₄产量。试验进行了2个批次的重复。

1.4 测定指标及方法 1.4.1 底物营养成分的测定

底物营养成分的测定设置3个平行，平行样品测定结果的变异系数控制在5%以内。采用105 ℃烘箱烘干5 h后测定干物质含量；采用550 ℃马弗炉燃烧5 h后测定粗灰分含量，然后利用100减去粗灰分含量即为有机物含量；中性洗涤纤维含量采用Van Soest等^[13]的方法测定，且使用了热稳定的α-淀粉酶；酸性洗涤纤维含量根据AOAC(1991)^[14]方法测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法^[14]测定；钙含量采用高锰酸钾滴定法^[15]测定；磷含量采用钼黄比色法^[15]测定。

1.4.2 产气量测定

体外培养过程中分别读取0、1、2、3、6、8、10、12、16、20和24 h的培养管刻度值，计算不同时间点的体外产气量，并计算24 h的累积净产气量。

1.4.3 CH₄产量测定

在体外培养24 h后，将培养管取出，迅速放入冰水浴中中止发酵，用5 mL一次性注射器抽取发酵管中的气体，立即用TP-2060T气相色谱仪检测气体中的CH₄含量(色谱条件：TCD检测器，TDX-01填充柱，1 mm×3 mm×2 mm，进样口温度150 ℃，柱温120 ℃，检测器温度150 ℃，载气为氦气，流速50 mL/min，进样量0.1 mL)，并根据产气量和CH₄含量计算CH₄产量。

1.4.4 体外发酵参数测定

在体外培养24 h后，将采集气体后的培养管中的发酵液排出，立即测定发酵液pH；然后将培养管的发酵液离心(800×g，15 min)，取1 mL上清液加入1.5 mL离心管(预先加入200 μL 25%偏磷酸冷冻保存的)中，用于挥发性脂肪酸(VFA)浓度测定，采用气相色谱法测定VFA浓度^[16]；另取4 mL上清液加入5 mL离心管(预先加入0.8 mL 1%硫酸冷冻保存的)中，用于NH₃-N浓度测定，采用苯酚-次氯酸钠比色法^[17]测定瘤胃液中NH₃-N的浓度。所有待测样品均保存于-20 ℃冰箱。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SAS 9.4的广义线性模型(GLM)进行统计分析，按单因子试验设计进行方差分析和多重比较，2个批次的重复试验，每个处理的重复数为6，对不同剂量植物精油产品对体外瘤胃发酵和CH₄产量的影响采用线性(L)和二次曲线(Q)比较，显著性水平定为P < 0.05。

2 结果 2.1 不同植物精油对体外瘤胃发酵参数的影响 2.1.1 不同植物精油对体外瘤胃发酵液pH的影响

由表 2可以看出，添加山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液pH(P < 0.05)。与对照组相比，添加200 mg/L苍子油和400 mg/L茴香油体外瘤胃发酵液pH显著降低(P < 0.05)，且随着肉桂油和茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。而添加桉叶油、肉桂油对体外瘤胃发酵液pH没有显著影响(P>0.05)。

表 2 不同植物精油对体外瘤胃发酵液pH的影响 Table 2 Effects of different plant essential oils on rumen fermentation fluid pH in vitro

2.1.2 不同植物精油对体外体外瘤胃发酵液VFA浓度的影响

由表 3可以看出，添加山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液总VFA浓度(P < 0.05)，而添加桉叶油、肉桂油对体外瘤胃发酵液总VFA浓度没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液总VFA浓度(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)；添加200和400 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液总VFA浓度(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。

表 3 不同植物精油对体外瘤胃发酵液VFA浓度的影响 Table 3 Effects of different plant essential oils on rumen fermentation fluid VFA concentration in vitro

项目 Items	植物精油 Plant essential oils	浓度Concentration/(mg/L)					SEM	P值 P-value
项目 Items	植物精油 Plant essential oils	0	50	100	200	400	SEM	处理Treatment	线性Linear	二次Quadratic
总VFA浓度 Total VFA concentration/(mmol/L)	桉叶油Eucalyptus oil	77.7	87.9	84.5	86.5	80.7	5.54	0.69	0.92	0.27
	山苍子油Litsea cubeba oil	77.7^a	73.4^a	72.3^a	68.4^a	55.8^b	3.49	< 0.01	< 0.01	0.74
	肉桂油Cinnamon oil	77.7^a	69.9^ab	70.4^ab	71.0^ab	60.9^b	3.24	0.05	< 0.01	0.93
	茴香油Anise oil	77.7^a	67.5^bc	72.3^ab	61.6^c	58.2^c	2.46	< 0.01	< 0.01	0.13
VFA比例Proportion of VFA/%
乙酸 Acetate	桉叶油Eucalyptus oil	67.0	67.0	67.3	67.4	65.5	0.60	0.60	0.08	0.15
	山苍子油Litsea cubeba oil	67.0^b	67.0^b	67.0^b	68.3^b	72.6^a	0.32	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	67.0	66.6	66.8	66.0	68.6	0.92	0.39	0.20	0.16
	茴香油Anise oil	67.0^b	66.7^b	66.2^b	65.8^b	69.8^a	0.43	< 0.01	< 0.01	< 0.01
丙酸 Propionate	桉叶油Eucalyptus oil	16.7^b	16.4^b	16.4^b	16.4^b	22.7^a	0.40	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	山苍子油Litsea cubeba oil	16.7^b	16.8^b	16.9^b	19.0^a	13.4^c	0.42	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	16.7	16.9	16.8	17.6	17.5	0.73	0.86	0.38	0.68
	茴香油Anise oil	16.7^b	17.1^b	17.5^b	20.5^a	17.9^b	0.35	< 0.01	< 0.01	< 0.01
乙酸/丙酸 Acetate/propionate	桉叶油Eucalyptus oil	4.01^a	4.10^a	4.10^a	3.97^a	2.89^b	0.10	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	山苍子油Litsea cubeba oil	4.01^b	3.99^b	3.98^b	3.61^b	5.40^a	0.10	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	4.01	3.94	3.97	3.76	3.99	0.20	0.90	0.90	0.43
	茴香油Anise oil	4.01^a	3.91^a	3.79^a	3.21^b	3.90^a	0.09	< 0.01	0.13	< 0.01
异丁酸 Isobutyrate	桉叶油Eucalyptus oil	0.57^a	0.58^a	0.56^a	0.51^a	0.24^b	0.04	< 0.01	< 0.01	0.06
	山苍子油Litsea cubeba oil	0.57^a	0.57^a	0.59^a	0.28^b	0.18^b	0.04	< 0.01	< 0.01	0.63
	肉桂油Cinnamon oil	0.57^a	0.53^a	0.52^a	0.54^a	0.31^b	0.04	< 0.01	< 0.01	0.08
	茴香油Anise oil	0.57^a	0.55^a	0.56^a	0.33^b	0.22^c	0.03	< 0.01	< 0.01	0.69
丁酸 Butyrate	桉叶油Eucalyptus oil	14.1^a	14.5^a	14.2^a	13.6^a	10.2^b	0.31	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	山苍子油Litsea cubeba oil	14.1^a	14.0^a	14.0^a	11.1^a	12.7^b	0.37	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	14.1^a	14.4^a	14.3^a	14.3^a	12.2^b	0.44	< 0.05	< 0.01	0.83
	茴香油Anise oil	14.1^a	14.1^a	14.1^a	12.0^b	11.0^c	0.23	< 0.01	< 0.01	0.58
异戊酸 Isovalerate	桉叶油Eucalyptus oil	1.11^a	1.14^a	1.05^a	1.05^a	0.78^b	0.05	< 0.01	< 0.01	0.18
	山苍子油Litsea cubeba oil	1.11^a	1.14^a	1.13^a	0.85^b	0.52^c	0.04	< 0.01	< 0.01	0.10
	肉桂油Cinnamon oil	1.11^a	1.12^a	1.11^a	1.10^a	0.83^b	0.05	0.01	< 0.01	0.08
	茴香油Anise oil	1.11^a	1.10^a	1.14^a	0.87^b	0.54^c	0.03	< 0.01	< 0.01	< 0.05
戊酸 Valerate	桉叶油Eucalyptus oil	0.48	0.48	0.48	0.49	0.53	0.02	0.22	< 0.05	0.31
	山苍子油Litsea cubeba oil	0.48	0.49	0.46	0.44	0.56	0.03	0.07	0.05	< 0.05
	肉桂油Cinnamon oil	0.48	0.47	0.47	0.49	0.54	0.02	0.11	< 0.05	0.22
	茴香油Anise oil	0.48	0.45	0.49	0.53	0.50	0.02	0.18	0.13	0.28

表 3 不同植物精油对体外瘤胃发酵液VFA浓度的影响 Table 3 Effects of different plant essential oils on rumen fermentation fluid VFA concentration in vitro

添加山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液乙酸比例(P < 0.05)，而添加桉叶油、肉桂油对体外瘤胃发酵液乙酸比例没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L山苍子油和茴香油显著增加了体外瘤胃发酵液乙酸比例(P < 0.05)，且随着山苍子油和茴香油添加浓度增加呈二次曲线上升趋势(P < 0.05)。

添加桉叶油、山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液丙酸比例(P < 0.05)，而添加肉桂油对体外瘤胃发酵液丙酸比例没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L桉叶油显著增加了体外瘤胃发酵液丙酸比例(P < 0.05)，且随着桉叶油添加浓度的增加呈二次曲线上升趋势(P < 0.05)；添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液丙酸比例(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈先上升后下降的二次曲线趋势(P < 0.05)；添加200 mg/L茴香油显著增加了体外瘤胃发酵液丙酸比例(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度的增加呈先上升后下降的二次曲线趋势(P < 0.05)。

添加桉叶油、山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液乙酸/丙酸(P < 0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L桉叶油显著降低了体外瘤胃发酵液乙酸/丙酸(P < 0.05)，且随着桉叶油添加浓度的增加呈先上升后下降的二次曲线趋势(P < 0.05)；添加400 mg/L山苍子油显著增加了体外瘤胃发酵液乙酸/丙酸(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈先下降后上升的二次曲线趋势(P < 0.05)；添加200 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液乙酸/丙酸(P < 0.05)，且随茴香油添加浓度的增加呈先下降后上升的二次曲线趋势(P < 0.05)。

添加桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油显著影响体外瘤胃发酵液异丁酸、丁酸和异戊酸比例(P < 0.05)，且随着桉叶油添加浓度的增加体外瘤胃发酵液丁酸比例呈先增加后降低的二次曲线趋势(P < 0.05)，随着山苍子油添加浓度的增加体外瘤胃发酵液丁酸比例呈先下降后上升的二次曲线趋势(P < 0.05)，随着茴香油添加浓度的增加体外瘤胃发酵液异戊酸比例呈先增加后降低的二次曲线趋势(P < 0.05)；除此之外，体外瘤胃发酵液的这几种VFA比例均随桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。添加桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油对体外瘤胃发酵液戊酸比例无显著影响(P>0.05)。

2.1.3 不同植物精油对体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度的影响

由表 4可以看出，添加茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度(P < 0.05)，而添加其他植物精油对体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。

表 4 不同植物精油对体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度的影响 Table 4 Effects of different plant essential oils on rumen fermentation fluid NH₃-N concentration in vitro

2.2 不同植物精油对体外瘤胃发酵液产气量和CH₄产量的影响

由表 5可以看出，添加山苍子油和茴香油显著影响体外瘤胃发酵液的产气量(P < 0.05)，而添加桉叶油和肉桂油对体外瘤胃发酵液的产气量没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L茴香油显著降低了体外发酵液的产气量(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)；添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液的产气量(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈先上升后下降的二次曲线趋势(P < 0.05)。

表 5 不同植物精油对体外瘤胃发酵液产气量和CH₄产量的影响 Table 5 Effects of different plant essential oils on rumen fermentation fluid gas production and CH₄ production in vitro

项目 Items	植物精油 Plant essential oils	浓度Concentration/(mg/L)					SEM	P值P-value
项目 Items	植物精油 Plant essential oils	0	50	100	200	400	SEM	处理 Treatment	线性 Linear	二次 Quadratic
产气量 Gas production/mL	桉叶油Eucalyptus oil	51.6	46.2	56.4	53.5	49.0	3.40	0.32	0.82	0.26
	山苍子油Litsea cubeba oil	51.6^a	52.6^a	55.3^a	50.7^a	36.4^b	1.38	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	51.6	52.9	55.2	52.0	37.1	5.05	0.16	< 0.05	0.18
	茴香油Anise oil	51.6^ab	53.2^a	50.6^ab	46.3^b	40.9^c	1.44	< 0.01	< 0.01	0.74
CH₄含量 CH₄ content/%	桉叶油Eucalyptus oil	21.6	22.5	22.3	20.6	18.6	1.01	0.11	< 0.05	0.46
	山苍子油Litsea cubeba oil	21.6^a	23.0^a	22.6^a	21.2^a	15.8^b	0.72	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	21.6	19.7	18.3	21.0	14.0	2.66	0.33	0.09	0.54
	茴香油Anise oil	21.6^a	20.2^a	20.8^a	17.6^a	14.1^b	1.07	< 0.01	< 0.01	0.86
CH₄产量 CH₄ production/mL	桉叶油Eucalyptus oil	11.1^ab	11.8^ab	12.6^a	11.0^ab	9.1^c	0.62	< 0.05	< 0.01	0.08
	山苍子油Litsea cubeba oil	11.1^b	12.1^a	12.5^a	10.7^b	5.7^c	0.29	< 0.01	< 0.01	< 0.01
	肉桂油Cinnamon oil	11.1	10.4	10.1	10.9	7.3	1.03	0.13	< 0.05	0.31
	茴香油Anise oil	11.1^a	10.7^a	10.5^a	8.1^b	5.8^c	0.50	< 0.01	< 0.01	1.00

添加山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液的CH₄含量(P < 0.05)，而其添加他植物精油对体外瘤胃发酵液的CH₄含量没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液的CH₄含量(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈先增加后降低二次曲线趋势(P < 0.05)；添加400 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液的CH₄含量(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。

添加桉叶油、山苍子油、茴香油显著影响了体外瘤胃发酵液的CH₄产量(P < 0.05)，而添加肉桂油对体外瘤胃发酵液的CH₄产量没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，添加400 mg/L桉叶油显著降低了体外瘤胃发酵液的CH₄产量(P < 0.05)，且随着桉叶油添加浓度的增加呈先升高后降低趋势；添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液的CH₄产量(P < 0.05)，且随着山苍子油添加浓度的增加呈先升高后降低的二次曲线趋势(P < 0.05)；添加200和400 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液的CH₄产量(P < 0.05)，且随着茴香油添加浓度的增加呈线性下降趋势(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 不同植物精油对体外瘤胃发酵参数的影响

精油的历史可以追溯到1 000年前，中国是最早把芳香植物精油用于维持健康的国家，中国也是植物精油的产销大国。本试验选用的4种植物精油，桉叶油、山苍子油、肉桂油和茴香油在我国产量居世界首位。

反刍动物的瘤胃液pH可以反映瘤胃内环境状态，它受饲粮类型、动物唾液分泌量及有机酸积累等的共同影响，然而不同科研人员用不同植物精油得出的结果可能不尽相同。Khateri等^[18]的研究发现，绵羊饲粮中补充1.6 mL混合植物精油(MEO)(50%百里香、30%肉桂和20%丁香精油)其瘤胃pH的最小值、最大值和平均值均没有受到显著影响；当给绵羊饲粮中补充0.8 mL MEO时，瘤胃pH最低点出现在07：00，可能的原因是MEO通过改变瘤胃内环境进而影响瘤胃pH。Chaves等^[19]观察到当羔羊饲喂MEO(200 mg/d，肉桂醛油、大蒜油和杜松子油)时，瘤胃pH下降。此外，Benchaar等^[20]和Yang等^[21]报道，对奶牛和肉牛每头分别添加400和1 000 mg/d的肉桂醛时，奶牛和肉牛的瘤胃pH没有变化。在本试验中，仅在添加200 mg/L山苍子油和400 mg/L茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液pH；添加其他浓度的各种植物精油对体外瘤胃发酵液的pH均没有显著影响。由于体外瘤胃发酵试验中缓冲液对维持pH的恒定具有重要作用，本研究中添加200 mg/L山苍子油和400 mg/L茴香油引起体外瘤胃发酵液pH降低的原因可能是显著降低了总VFA浓度。不同研究者对添加植物精油对总VFA浓度影响的结果并不相同。Busquet等^[22]研究发现，体外发酵试验中底物精粗比为7 : 3时添加0.3~3.0 mg/L肉桂醛提高了总VFA浓度；体外发酵24 h后，不同添加水平的大蒜油均提高了总VFA浓度。Castillejos等^[9]在连续体外瘤胃发酵培养试验中维持恒定的pH，添加1.5 mg/L的MEO增加了总VFA浓度，但没有增加营养物质的消化率；Newbold等^[23]体内试验采用110 mg/d的MEO饲喂绵羊和Beauchemin等^[24]饲喂采用1 g/d的MEO饲喂肉牛，对总VFA浓度和各种VFA的比例均没有产生显著影响。本试验中，当底物精粗比为60 : 40时，添加桉叶油对总VFA浓度无显著影响，但高浓度(400 mg/L)的山苍子油和茴香油则使总VFA浓度下降。

饲粮消化率与体外瘤胃发酵培养时的产气量具有高度相关性，饲粮在瘤胃内的降解率越高，产气量则越大。研究发现，添加高浓度(300 mg/L以上)的大蒜油时产气量显著降低，对体外瘤胃发酵存在负面影响；添加低浓度的大蒜油既能抑制CH₄的产生，又对产气量无显著影响^[25]。莫能菌素具有降低乙酸比例和增加丙酸比例的作用，同样某些植物精油及其复合成分也能改变VFA的比例，这些被广大科研人员视为是添加植物精油的有利影响。Busquet等^[22]使用低剂量的肉桂醛和高剂量的大蒜油都使得乙酸比例下降而丙酸比例上升。Castillejos等^[9]研究发现，添加一些植物精油会使丙酸比例下降而没有影响总VFA浓度。Devant等^[26]给高精料饲养的荷斯坦公牛饲喂适量的洋蓟、刺五加和葫芦巴混合物的提取物，与对照组相比，提高了瘤胃丙酸比例，且这种效果在高精料饲喂的情况下更显著。本试验中，添加400 mg/L山苍子油和茴香油显著提高了体外瘤胃发酵液乙酸比例，添加400 mg/L桉叶油及200 mg/L茴香油和山苍子油显著提高了体外瘤胃发酵液丙酸比例，添加400 mg/L桉叶油和200 mg/L茴香油显著提高了体外瘤胃发酵液乙酸/丙酸，添加400 mg/L山苍子油显著降低了体外瘤胃发酵液丙酸比例，添加400 mg/L山苍子油和茴香油显著降低了体外瘤胃发酵液总VFA浓度，可能的原因是体外瘤胃发酵受到一定抑制的原因。

瘤胃中氮存留率是评价反刍动物饲料蛋白质利用率的重要标志，较高的氮存留率可以提高反刍动物对饲料蛋白质的利用效率，并且减少粪氮和尿氮的排出。氨是瘤胃中微生物生长的氮源之一，因此评价瘤胃氮存留率应结合NH₃-N浓度^[26]。金恩望等^[28]通过体外试验证明，添加低浓度肉桂油油体外培养72 h内瘤胃微生物不断降解饲料中蛋白质生成NH₃-N，而当添加浓度为1 500 mg/L时NH₃-N的浓度随发酵时间延长变化趋势不显著，可能由于高剂量肉桂油杀死了发酵液中可降解微生物蛋白质的微生物菌群。与本试验中添加低浓度茴香油可以提高24 h体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度，而高浓度添加组则显著降低体外瘤胃发酵液NH₃-N浓度的结果相一致。Cao等^[16]试验表明，丁香油、百里香油、茴香油、薄荷油、茶树油等植物精油均具有降低体外发酵瘤胃液NH₃-N浓度的能力，其中百里香油和薄荷油的效果最显著，与本试验中添加茴香油降低体外发酵瘤胃液NH₃-N浓度的结果一致。

3.2 不同植物精油对体外发酵瘤胃液CH₄产量的影响

各种添加剂在降低反刍动物CH₄产量方面取得了很好的效果，但是随着人类健康意识的提高，添加剂的种种弊端凸显。近些年广大科研人员在天然植物精油替代添加剂方面做了大量的研究工作，并且取得良好的效果。一些植物精油可以通过直接抑制有助于CH₄生成的微生物代谢过程来抑制CH₄古生物或间接地降低CH₄的产生。添加植物精油也可能会改变古细菌群落结构或使CH₄生成途径发生变化，从而减少产CH₄菌丰度和CH₄产量^[29]。此外，植物精油还可以通过减少与古细菌共生相关的一些原生动物的丰度来减少CH₄生成，并且可以显著减少瘤胃CH₄产生(高达37%)^[30]。Oskoueian等^[31]认为，植物精油在降低CH₄产量的同时伴随着对瘤胃微生物发酵的抑制，这种改变与植物精油的种类和剂量以及所采用的底物有关。Cobellis等^[32]研究显示，浓度为4.5%的柚皮苷和槲皮素维持了瘤胃微生物发酵活性，抑制了CH₄产生，降低了瘤胃原生动物和产CH₄菌种群。Patra等^[33]采用5种不同的植物精油(丁香油、桉树油、大蒜油、起酥油、和薄荷油)研究发现，使用1 g/L牛至和大蒜油时，CH₄产量降低最多，表明植物精油对CH₄产量降低的效果与植物精油的种类和剂量有关。Jayanegara等^[34]报道，添加单宁在降低CH₄产量方面存在单宁种类(纯化的可水解和缩合单宁)和剂量(0.50、0.75、1.00 mg/mL)之间的互作反应，所有单宁都以线性或二次曲线方式降低CH₄产量。Pinski等^[35]试验研究中发现，瘤胃培养物添加125和250 mg/L肉桂油，对总VFA浓度没有影响，但添加500 mg/L的肉桂油导致CH₄产量降低，有可能是由于对产CH₄菌的抑制以及对发酵产生的负面影响。林波等^[36]体外瘤胃发酵研究发现，添加牛至油和肉桂油发挥最理想的瘤胃调控作用的剂量为50 mg/L，可分别降低CH₄产量13.3%和21.2%。本试验中添加不同剂量的山苍子油、茴香油均显著影响体外发酵瘤胃液CH₄产量，在高浓度(400 mg/L)时显著降低CH₄产量，CH₄产量分别降低了48.6%和47.7%，且总VFA浓度和产气量也显著下降，CH₄产量降低的同时瘤胃发酵也受到了抑制。与前人有关植物精油或者提取物在降低CH₄产量的同时起到抑制瘤胃原生动物、发酵细菌和产CH₄菌的结果一致^[37]。

另外，本试验中添加400 mg/L的肉桂油与对照组相比CH₄产量减少了34.23%，可能的原因是该浓度下的肉桂油促进了瘤胃发酵及瘤胃微生物的活性，表明植物精油对CH₄的影响与植物精油种类和剂量有关。

国内外关于植物精油的试验大多仍集中在体外瘤胃发酵试验，研究结果表明植物精油在降低CH₄产量的同时对瘤胃发酵及饲料转化率有一定的影响。而应用于动物生产中，由于植物精油的剂量、种类、化学组成以及动物的饲粮类型和饲养方式的不同，在瘤胃中确定植物精油有效浓度方面还需要深入研究。未来广大科研人员面临的主要挑战是寻找既能降低CH₄产量又不影响饲料消化甚至能提高饲料利用率的理想植物精油。

4 结论

本试验条件下，添加4种不同天然植物精油对体外瘤胃发酵参数和CH₄产量的影响不同，且与剂量有关。其中，添加山苍子油和茴香油显著影响了体外瘤胃发酵参数和CH₄产量，高浓度(400 mg/L)时显著降低总VFA含量并影响发酵模式，且降低产气量和CH₄产量；添加不同浓度桉叶油对总VFA浓度无显著影响，且不影响产气量和CH₄产量，但高浓度(400 mg/L)时提高了丙酸比例，降低了CH₄产量；而添加不同浓度肉桂油对体外瘤胃发酵参数和CH₄产量均无显著影响。

参考文献

[1]	SHINDELL D T, FALUVEQI G, KOCH D M, et al. Improved attribution of climate forcing to emissions[J]. Science, 2009, 326(5953): 716-718. DOI:10.1126/science.1174760
[2]	KIRSCHKE S, BOUSQUET P, CIAIS P, et al. Three decades of global methane sources and sinks[J]. Nature Geoscience, 2013, 6(10): 813-823. DOI:10.1038/ngeo1955
[3]	LASSEY K R. Livestock methane emission and its perspective in the global methane cycle[J]. Australian Journal of Experimental Agriculture, 2008, 48(2): 114-118. DOI:10.1071/EA07220
[4]	ECKARD R J, GRAINGER C, DE KLEIN C A M. Options for the abatement of methane and nitrous oxide from ruminant production:a review[J]. Livestock Science, 2010, 130(1/2/3): 47-56.
[5]	SALLAM S, BUENO I C S, BRIGIDE P, et al. Investigation of potential new opportunities for plant extracts on rumen microbial fermentation in vitro[J]. Options Méditerranéennes Série A Séminai, 2009, 85: 255-260.
[6]	MOLERO R, IBARS M, CALSAMIGLIA S, et al. Effects of a specific blend of essential oil compounds on dry matter and crude protein degradability in heifers fed diets with different forage to concentrate ratios[J]. Animal Feed Science and Technology, 2004, 114(1/2/3/4): 91-104.
[7]	CARDOZO P W, CALSAMIGLIA S, FERRET A, et al. Screening for the effects of natural plant extracts at different pH on in vitro rumen microbial fermentation of a high-concentrate diet for beef cattle[J]. Journal of Animal Science, 2005, 83(11): 2572-2579. DOI:10.2527/2005.83112572x
[8]	BUSQUET M, CALSAMIGLIA S, FERRET A, et al. Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(2): 761-771. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(06)72137-3
[9]	CASTILLEJOS L, CALSAMIGLIA S, FERRET A. Effect of essential oil active compounds on rumen microbial fermentation and nutrient flow in in vitro systems[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(7): 2649-2658. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(06)72341-4
[10]	CALSAMIGLIA S, BUSQUET M, CARDOZO P W, et al. invited review:essential oils as modifiers of rumen microbial fermentation[J]. Journal of Dairy Science, 2007, 90(6): 2580-2595. DOI:10.3168/jds.2006-644
[11]	LI Y L, HE M L, LI C, et al. Effects of wheat dried distillers grains with solubles and cinnamaldehyde on in vitro fermentation and protein degradation using the Rusitec technique[J]. Archives of Animal Nutrition, 2012, 66(2): 131-148. DOI:10.1080/1745039X.2012.656479
[12]	MENKE K H, RAAB L, SALEWSKI A, et al. The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro[J]. The Journal of Agricultural Science, 1979, 93(1): 217-222. DOI:10.1017/S0021859600086305
[13]	VAN SOEST P J, ROBERTSON J B, LEWIS B A. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J]. Journal of Dairy Science, 1991, 74(10): 3583-3597. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2
[14]	AOAC.Official methods of analysis[S]. 16th ed.Arlington, VA: Association of Official Analytical Chemists, 1995.
[15]	张丽英. 饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 3版. 北京: 中国农业大学出版社, 2007: 140-147.
[16]	CAO Y C, YANG H J. Ruminal digestibility and fermentation characteristics in vitro of fenugreek and alfalfa hay combination with or without the inoculation of Neocallimastix sp.YAK11[J]. Animal Feed Science and Technology, 2011, 169(1/2): 53-60.
[17]	BRODERICK G A, KANG J H. Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media[J]. Journal of Dairy Science, 1980, 63(1): 64-75. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(80)82888-8
[18]	KHATERI N, AZIZI O, JAHANI-AZIZABADI H. Effects of a specific blend of essential oils on apparent nutrient digestion, rumen fermentation and rumen microbial populations in sheep fed a 50:50 alfalfa hay:concentrate diet[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2017, 30(3): 370-378.
[19]	CHAVES A V, STANFORD K, DUGAN M E R, et al. Effects of cinnamaldehyde, garlic and juniper berry essential oils on rumen fermentation, blood metabolites, growth performance, and carcass characteristics of growing lambs[J]. Livestock Science, 2008, 17(2/3): 215-224.
[20]	BENCHAAR C, MCALLISTER T A, CHOUINARD P Y. Digestion, ruminal fermentation, ciliate protozoal populations, and milk production from dairy cows fed cinnamaldehyde, quebracho condensed tannin, or Yucca schidigera saponin extracts[J]. Journal of Dairy Science, 2008, 91(12): 4765-4777. DOI:10.3168/jds.2008-1338
[21]	YANG W Z, AMETAJ B N, BENCHAAR C, et al. Dose response to cinnamaldehyde supplementation in growing beef heifers:ruminal and intestinal digestion[J]. Journal of Animal Science, 2010, 88(2): 680-688. DOI:10.2527/jas.2008-1652
[22]	BUSQUET M, CALSAMIGLIA S, FERRET A, et al. Effects of cinnamaldehyde and garlic oil on rumen microbial fermentation in a dual flow continuous culture[J]. Journal of Dairy Science, 2005, 88(7): 2508-2516. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(05)72928-3
[23]	NEWBOLD C J, MCINTOSH F M, WILLIAMS P, et al. Effects of a specific blend of essential oil compounds on rumen fermentation[J]. Animal Feed Science and Technology, 2004, 114(1/2/3/4): 105-112.
[24]	BEAUCHEMIN K A, MCGINN S M. Methane emissions from beef cattle:effects of fumaric acid, essential oil, and canola oil[J]. Journal of Animal Science, 2006, 84(6): 1489-1496.
[25]	BUSQUET M, CALSAMIGLIA S, FERRET A, et al. Effects of cinnamaldehyde and garlic oil on rumen microbial fermentation in a dual flow continuous culture[J]. Journal of Dairy Science, 2005, 88(7): 2508-2516. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(05)72928-3
[26]	DEVANT M, ANGLADA A, BACH A. Effects of plant extract supplementation on rumen fermentation and metabolism in young Holstein bulls consuming high levels of concentrate[J]. Animal Feed Science and Technology, 2007, 137(1/2): 46-57.
[27]	王宇星, 隋美霞, 刘海霞, 等. 香精油对反刍动物瘤胃发酵的影响[J]. 饲料博览, 2010(2): 7-10.
[28]	金恩望, 卜登攀, 王加启, 等. 利用双外流持续发酵系统研究植物精油对瘤胃发酵和甲烷生成的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(10): 2303-2314. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2013.10.014
[29]	BHATTA R.Reducing enteric methane emission using plant secondary metabolites[M]//SEJIAN V, GAUGHAN J, BAUMGARD L, et al.Climate change impact on livestock: adaptation and mitigation.New Delhi: Springer, 2015: 273-284.
[30]	SZUMACHER-STRABEL M, CIESLAK A. Potential of phytofactors to mitigate rumen ammonia and methane production[J]. Journal of Animal and Feed Sciences, 2010, 19(3): 319-337. DOI:10.22358/jafs/66296/2010
[31]	OSKOUEIAN E, ABDULLAH N, OSKOUEIAN A. Effects of flavonoids on rumen fermentation activity, methane production, and microbial population[J]. BioMed Research International, 2013, 2013: 349129.
[32]	COBELLIS G, TRABALZA-MARINUCCI M, YU Z T. Critical evaluation of essential oils as rumen modifiers in ruminant nutrition:a review[J]. Science of the Total Environment, 2016, 545/546: 556-568. DOI:10.1016/j.scitotenv.2015.12.103
[33]	PATRA A K, YU Z T. Effects of essential oils on methane production and fermentation by, and abundance and diversity of, rumen microbial populations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(12): 4271-4280. DOI:10.1128/AEM.00309-12
[34]	JAYANEGARA A, GOEL G, MAKKAR H P S, et al. Divergence between purified hydrolysable and condensed tannin effects on methane emission, rumen fermentation and microbial population in vitro[J]. Animal Feed Science and Technology, 2015, 209: 60-68. DOI:10.1016/j.anifeedsci.2015.08.002
[35]	PINSKI B, GVNAL M, ABUGHAZALEH A A. The effects of essential oil and condensed tannin on fermentation and methane production under in vitro conditions[J]. Animal Production Science, 2015, 56(10): 1707-1713.
[36]	林波, 纪苗苗, 梁权, 等. 肉桂油和牛至油及其主要成分对体外瘤胃发酵和甲烷产生的影响[J]. 中国兽医学报, 2011, 31(2): 279-282, 287.
[37]	PATRA A K, SAXENA J. A new perspective on the use of plant secondary metabolites to inhibit methanogenesis in the Rumen[J]. Phytochemistry, 2010, 41(11/12): 1198-1222.