蛋鸡的生殖活动主要受下丘脑-垂体-性腺构成的生殖轴调控，但繁殖性状属于数量性状，也受温度、光照和饲粮营养水平等因素影响。比如高温环境下，蛋鸡卵巢质量降低，卵泡数量减少，血浆生殖激素含量降低，产蛋性能下降[1-2]，这些可能与体内皮质醇(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)含量的升高对促性腺激素的分泌具有抑制作用有关[3-4]。雷凯[5]报道，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)能降低蛋鸡血清ACTH含量，提高促卵泡激素(FSH)和雌二醇(E2)含量，上调卵巢促性腺激素释放激素(GnRH)mRNA的表达量，降低胃饥饿素mRNA的表达量；李天杰[6]指出，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)可促进蛋鸡卵巢雌激素受体α(ESRα)和雌激素受体β(ESRβ)mRNA的表达量，抑制催乳素受体(PRLR)mRNA的表达量。此外，本课题组最近的研究表明，蒙脱石(montmorillonite，MMT)、BS及其联用均能改善蛋鸡生产性能[7]，推测可能与其调节体内生殖激素的分泌、卵巢繁殖相关基因的表达和改善肠道微生物有关。同时，目前尚未有关于MMT和BS对蛋鸡生殖激素分泌和繁殖相关基因表达互作效应的研究。肠道微生物的稳态对维持宿主的生长或生产、养分吸收和免疫应答等具有重要作用。研究表明，MMT和嗜酸乳杆菌联用对调节仔猪肠道菌群的作用优于这二者单独使用[8]，提示MMT和益生菌在改善肠道菌群方面可能具有协同作用，目前，虽然关于MMT和BS单独对蛋鸡肠道菌群影响的研究已有报道，但二者之间是否存在协同作用尚不明确。因此，本试验旨在探讨MMT、BS及其互作对夏季蛋鸡血浆激素含量、卵巢繁殖相关基因表达和肠道微生物的影响，并观察MMT和BS是否具有协同作用，以期为其在蛋鸡生产中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料MMT为市售产品，其主要成分为：MMT>70%，无定形水合二氧化硅>15%，其他矿物元素 < 15%。BS为市售产品，活菌数≥1×109 CFU/g。
1.2 试验设计及饲粮本试验于2017年7月21日至2017年10月7日在湖南生安赛特农牧科技有限公司进行。采用2×2双因子随机设计，选择360只29周龄健康的罗曼蛋鸡，随机分成4组(每组6个重复，每个重复15只)，分别饲喂基础饲粮(对照组)、基础饲粮+0.5 g/kg MMT(MMT组)、基础饲粮+5×108 CFU/kg BS(BS组)、基础饲粮+0.5 g/kg MMT+5×108 CFU/kg BS(MMT+BS组)。预试期7 d，正试期70 d。预试期各组蛋鸡统一饲喂基础饲粮，每天对鸡群进行观察，并及时调整鸡群，使各组蛋鸡的平均日采食量[(116.61±0.45) g，P=0.603]、产蛋率[(95.72±0.48)%，P=0.955]和蛋重[(59.90±0.21) g，P=0.689]差异不显著。试验用基础饲粮参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)并结合生产实际配制，其组成及营养水平见表 1。在基础饲粮配制好后，准确称取所需的MMT和BS添加到基础饲粮中，逐级充分混匀，在配制MMT+BS组试验饲粮时，先将所需的MMT和BS充分混匀后再逐级混匀于基础饲粮中。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
蛋鸡采用上、中、下3层阶梯式笼养，每笼3只，每5笼1个重复，各组的试验鸡保证分布在上、中、下层的数量相等。每日喂料2次，捡蛋2次，上午、下午各匀料2次。各组蛋鸡饲养管理条件相同，试验第1~5周鸡舍温度、相对湿度分别为(27.06±2.27) ℃、(77.39±6.13)%；试验第6~10周鸡舍温度、相对湿度分别为(24.03±2.40) ℃、(77.07±6.21)%。蛋鸡自由采食、饮水，每日光照时间为16 h，自然光照和人工光照相结合。每日清扫鸡舍1次，每周对鸡舍喷雾消毒2次，每隔3 d清粪1次。
1.4 样品采集试验第70天，以重复为单位随机选取2只蛋鸡，采血前禁食12 h，自由饮水。通过翅下静脉采集5 mL左右血液于肝素抗凝管中，于3 000 r/min离心10 min制备血浆，置于-20 ℃冰箱保存。另从每个重复随机选取1只鸡(未禁食)，颈部放血后剖开腹腔，取适量十二指肠和回肠内容物分别置于1.5 mL高压灭菌离心管中；并用灭菌剪刀剪取适量卵巢样品，用灭菌锡箔纸包好，并迅速放置液氮中保存，然后于-80 ℃冰箱冻存。
1.5 检测指标与方法 1.5.1 血浆指标使用北京华英生物技术研究所生产的试剂盒测定血浆FSH、E2、促黄体生成素(LH)、孕酮(P)、CORT和ACTH含量。
1.5.2 卵巢繁殖相关基因mRNA表达使用Trizol法提取卵巢总RNA，并用蛋白核酸测定仪(赛默飞世尔，美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和质量后，利用反转录试剂盒反转录制备cDNA，并以其为模板使用荧光定量PCR试剂盒(宝生物，大连)进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR仪为CFX96型(伯乐，美国)，反应体系为10 μL：SYBR 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA 1 μL, 单蒸水3.2 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，39个循环；在65~95 ℃绘制熔解曲线。引物采用Primers软件设计，由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表 2，以β-肌动蛋白为参比基因，mRNA表达量数据采用2-ΔΔCt法计算。
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表 2 引物序列信息 Table 2 Information of primer sequences |
称取每份十二指肠和回肠内容物样品(200±10) mg置于2 mL离心管中，采用粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328，天根，北京)提取细菌DNA，并用蛋白核酸测定仪和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量。DNA样品浓度经3次检测后取其平均值，随后将所有样品浓度统一稀释至100 ng/μL。使用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应程序同1.5.2。引物采用Primers软件设计，由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表 2。以总菌为参比基因，采用2-ΔΔCt法计算目的细菌的相对含量[9, 11]。
1.6 数据统计与分析采用SAS 9.2统计软件中的一般线性模型(GLM)程序对数据进行2×2因子分析，差异显著者用Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值和集合标准误(SEM)表示，用P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有提高或降低的趋势。
2 结果 2.1 MMT、BS及其互作对蛋鸡血浆激素含量的影响由表 3可知，与对照组相比，MMT+BS组血浆FSH含量有提高的趋势(P=0.060)，MMT组ACTH含量较BS组显著降低(P < 0.05)。主效应分析表明，添加MMT和BS对血浆E2、LH、CORT和P含量均无显著影响(P>0.05)；添加MMT显著降低了ACTH含量(P < 0.05)，有降低CORT含量的趋势(P=0.087)；添加BS可显著提高FSH含量(P < 0.05)，有提高ACTH含量的趋势(P=0.083)；MMT和BS的互作效应对所测定的血浆激素指标均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 MMT、BS及其互作对蛋鸡血浆激素含量的影响 Table 3 Effects of MMT, BS and their interaction on of hormone contents in plasma of laying hens |
由表 4可知，各组间蛋鸡卵巢促卵泡激素受体(FSHR)、ESRβ和GnRH mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，试验组PRLR mRNA表达量均有不同程度的降低，其中MMT+BS组PRLR mRNA表达量显著低于对照组(P < 0.05)。BS组胃饥饿素mRNA表达量显著高于其他组(P < 0.05)。主效应分析表明，MMT对FSHR和PRLR mRNA表达量有显著影响(P < 0.05)，添加BS可显著降低胃饥饿素mRNA的表达量(P < 0.05)，有下调PRLR mRNA表达量的趋势(P=0.055)；MMT和BS对胃饥饿素mRNA表达量存在显著互作效应(P < 0.05)。
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表 4 MMT、BS及其互作对蛋鸡繁殖相关基因mRNA表达的影响 Table 4 Effects of MMT, BS and their interaction on mRNA expression of reproduction related genes in ovarian of laying hens |
由表 5、表 6可知，各组间蛋鸡十二指肠和回肠内容物肠球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌相对含量均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，试验组十二指肠产气荚膜梭菌、大肠杆菌和沙门氏菌相对含量均显著降低(P < 0.05)，乳酸杆菌和双歧杆菌相对含量有不同程度提高(P>0.05)；试验组回肠产气荚膜梭菌相对含量显著减少(P < 0.05)。主效应分析表明，添加MMT和BS均显著减少了十二指肠产气荚膜梭菌和沙门氏菌的相对含量(P < 0.05)。此外，添加MMT显著降低了回肠产气荚膜梭菌相对含量(P < 0.05)，有降低十二指肠大肠杆菌相对含量的趋势(P=0.084)；添加BS有增加回肠双歧杆菌相对含量的趋势(P=0.074)。MMT和BS的互作效应对十二指肠产气荚膜梭菌、大肠杆菌和沙门氏菌相对含量有显著影响(P < 0.05)，对回肠产气荚膜梭菌相对含量也有显著影响(P < 0.05)。
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表 5 MMT、BS及其互作对蛋鸡十二指肠微生物相对含量的影响 Table 5 Effects of MMT, BS and their interaction on relative amounts of duodenal microorganisms of laying hens |
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表 6 MMT、BS及其互作对蛋鸡回肠微生物相对含量的影响 Table 6 Effects of MMT, BS and their interaction on relative amounts of ileal microorganisms of laying hens |
蛋鸡产蛋量与血浆生殖激素含量有一定的相关性。本试验发现，添加MMT对血浆FSH、E2、LH和P含量均无显著影响，提示MMT可能不影响体内生殖激素的分泌。但有意思的是，添加MMT降低了血浆ACTH和CORT含量。ACTH和CORT通常大量产生于冷、热应激和病原体感染的情况下[4-5]。我国南方地区的夏季，环境温度高、湿度大，蛋鸡长期处于高温高湿环境中，可能会使机体产生应激，进而危害机体健康，降低生产水平。以上结果表明，添加MMT可能有利于减少应激，进而改善了蛋鸡的生产性能[7]。
本试验发现，添加BS显著提高了血浆FSH含量，且在一定程度上提高了E2、LH和P含量，说明添加BS有利于维持蛋鸡体内较高的激素水平，进而提高其产蛋性能[7]。Lei等[4]报道，地衣芽孢杆菌能提高蛋鸡血清FSH和E2含量，降低ACTH和CORT含量。而本试验中，添加BS对血浆这2种应激激素含量没有显著影响。目前，益生菌对动物机体生殖激素分泌的调控机制尚未清楚，有待深入探讨。此外，本试验表明，MMT和BS对于血浆应激激素和生殖激素含量不存在显著的交互作用。
3.2 MMT、BS及其互作对蛋鸡卵巢繁殖相关基因mRNA表达的影响目前己知重要的蛋鸡繁殖性状候选基因有ESR、FSHR和PRLR等。ESRβ可通过卵巢内和卵巢外2种途径调节卵泡的发育和促进排卵[12]。FSH不能透过细胞膜，其结合FSHR后在颗粒细胞内引起一系列生理学效应，促进卵泡的发育和成熟[13]。本试验表明，添加MMT不影响蛋鸡卵巢ESRβ mRNA的表达，显著下调了FSHR mRNA的表达量，但MMT并没有影响血浆中FSH含量。目前，尚未见MMT对蛋禽繁殖相关基因表达影响的报道，当前的试验结果还有待进一步验证。本试验中，添加BS对卵巢ESRβ和FSHR mRNA的表达量均未产生显著影响，但显著提高了血浆FSH含量。有资料表明，蛋鸡血液中FSH含量与卵巢FSHR mRNA的表达量存在差异[4-5]，本试验的结果也证实了这一结论，禽类血液中生殖激素含量不仅受卵巢相应受体的调控，可能还受其他因素的影响；同时，本研究仅是从转录水平初步探讨了FSHR mRNA的表达情况，基因在转录水平上的表达与蛋白水平上的表达可能存在一定差异，本研究FSHR mRNA表达的结果还需在蛋白水平上进行验证。雷凯[5]发现，添加不同水平地衣芽孢杆菌对蛋鸡卵巢FSHR mRNA的表达量没有显著影响，但在每千克饲粮中添加7×109 CFU的地衣芽孢杆菌显著提高了ESRβ mRNA的表达量。李天杰[6]报道，添加BS(每千克饲粮中含1×1010 CFU)显著提高了蛋鸡卵巢ESRα和ESRβ mRNA的表达量，而添加相同水平的植物乳杆菌和戊糖片球菌不影响以上基因的表达。本试验结果与以上学者的报道不一致，可能是本试验所使用的BS浓度不能对蛋鸡的生殖系统(卵巢)产生显著刺激作用，另外不同种类的益生菌或不同芽孢杆菌菌株的特性也存在差异。
GnRH是下丘脑分泌产生的一种神经激素，能促进FSH和LH释放。Hu等[14]报道，GnRH与蛋鸡产蛋量有显著的相关性。有学者指出，地衣芽孢杆菌能显著提高蛋鸡卵巢中GnRH mRNA的表达量，同时血清FSH含量升高，并指出可能是由于GnRH通过下丘脑-垂体-卵巢轴引起垂体释放FSH[5]。本试验中，添加BS显著提高了血浆FSH含量，同时BS组卵巢GnRH mRNA的表达量较对照组提高了44.0%，提示BS可能通过在一定程度上调节GnRH mRNA的表达而提高血浆FSH含量。
本研究表明，添加MMT对卵巢胃饥饿素mRNA的表达量无显著影响，而添加BS显著降低了胃饥饿素mRNA的表达量。类似的，地衣芽孢杆菌显著降低了蛋鸡卵巢胃饥饿素mRNA的表达量[5]。研究表明，胃饥饿素具有抑制卵巢颗粒细胞分泌雌激素的作用[15]。本试验中，BS组蛋鸡卵巢FSHR、ESRβ的mRNA表达量和血浆E2、LH、P含量较对照组均有升高，且FSH含量显著提高，这可能与BS显著降低了卵巢胃饥饿素mRNA的表达量有关，雷凯[5]也得出了类似的推论。此外，本研究发现，MMT和BS对mRNA的表达量存在显著互作效应，即单独添加MMT上调了卵巢胃饥饿素mRNA的表达量，当其与BS联用后下调了胃饥饿素mRNA的表达量，基于上面的分析可以得出，二者对胃饥饿素的交互作用有助于维持蛋鸡体内正常的激素水平，进而提高蛋鸡的产蛋性能[7]，但其互作机制还有待深入研究。
研究证实，PRLR的mRNA表达量对蛋鸡的就巢起着很大作用，与产蛋量呈高度负相关[6, 16]。本试验表明，添加MMT显著降低了卵巢PRLR mRNA的表达量，BS有下调PRLR mRNA的表达量的趋势，且MMT+BS组PRLR mRNA的表达量显著低于对照组。李天杰[6]报道，添加BS能显著下调蛋鸡卵巢PRLR mRNA的表达量，显著提高产蛋率，而添加植物乳杆菌和戊糖片球菌对PRLR mRNA的表达量和产蛋率均无显著影响，提示产蛋率的提高与卵巢PRLR mRNA的表达量的降低有一定关系。综上，本研究中卵巢PRLR mRNA的表达量的降低可能是试验组蛋鸡生产性能提高的原因之一[7]。
3.3 MMT、BS及其互作对蛋鸡小肠内容物微生物相对含量的影响研究证实，MMT对有害菌有吸附作用，能固定细菌随肠道蠕动排出体外，减少其对动物的危害[17-18]。本试验表明，添加MMT能降低蛋鸡小肠内容物中有害菌相对含量，与前人的报道[18-20]基本一致。肠道中致病菌减少，将有助于有益菌增殖。本试验中，MMT添加后小肠乳酸杆菌和双歧杆菌相对含量均有一定程度的提高，但无显著变化，与Cao等[8]和Xia等[19]的报道一致。从MMT的作用机制上可知，其对有害菌的作用是直接的，而其可能是通过减少肠道有害菌，间接对有益菌的增殖带来益处，因此或许不能显著提高有益菌数量。
本研究表明，添加BS降低了蛋鸡小肠有害菌的相对含量，有提高回肠双歧杆菌相对含量的趋势，说明BS能优化肠道菌群，与前人的报道[21-22]基本一致。BS为需氧菌，能消耗肠道中大量的游离氧，有益于厌氧菌的增殖；而导致好氧致病菌的生长繁殖因缺氧而受到抑制[23-24]。此外，BS在形成芽孢过程中可分泌多种类抗生素物质如多黏菌素、伊枯草菌素，其对肠道致病菌具有拮抗作用[25-26]，进而调节肠道微生态平衡。
另外，本试验发现，对于小肠有害菌相对含量，MMT和BS之间存在显著互作效应。Cao等[8]在断奶仔猪上的研究表明，MMT和嗜酸乳杆菌联用对降低肠道大肠杆菌、提高乳酸杆菌含量的作用略优于这二者单独添加。以上提示MMT和益生菌在优化肠道菌群方面可能具有协同作用，其互作机制可能如下：MMT通过物理吸附作用，部分固定益生菌于其表面，使益生菌覆盖或埋藏于MMT颗粒中，可能为益生菌对抗消化道中恶劣环境提供物理屏障[27]；MMT可在消化道内延展，形成连续的保护膜，且能够与消化道黏液蛋白静电结合，促进黏液量的增加和黏液质量的改善，修复和保护肠道黏膜[28]，可能利于外源益生菌短暂定植于肠道，发挥生态效应；此外，MMT可吸附肠道有害菌，优化肠道菌群，或许间接提高了益生菌同有害菌的竞争力，增强益生功效。有学者指出，肠道有害菌的减少被认为是促生长或生产的一个因素，可能是由于宿主和微生物之间对营养物质的竞争减少了[29]。因此，MMT、BS及其联用改善蛋鸡生产性能可能与其降低肠道有害菌含量和一定程度增加有益菌含量有关。
4 结论① 饲粮中单独添加MMT或BS均能改善蛋鸡肠道菌群；添加MMT降低了血浆ACTH、CORT含量和卵巢FSHR、PRLR mRNA的表达量，BS可以提高血浆FSH含量，降低卵巢PRLR和胃饥饿素mRNA的表达量。
② 对于小肠产气荚膜梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌相对含量和卵巢胃饥饿素mRNA的表达量，MMT和BS存在显著交互作用，且二者联用降低了卵巢PRLR mRNA的表达量。
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