饲料添加剂是实现动物生长发育的重要营养来源。一方面，随着我国畜牧业的不断发展，大规模集约化的畜牧生产对饲料添加剂的需求量也在不断的增加；另一方面，人们对食品绿色、环保和安全的需求越来越高，饲料添加剂行业的转型升级进程加快，开发绿色、安全、高效的新型饲料添加剂势在必行。蚯蚓富含丰富的蛋白质，占干重的56%~70%，含有人体所需的17种氨基酸，其中必需氨基酸有7种，特别是赖氨酸含量高。蚯蚓体内还含有丰富的维生素、钙和磷等微量元素以及具有抗氧化作用酶等生物活性物质，在医学上具有很高的药用价值。研究表明，蚯蚓提取物具有抗氧化、抑制细菌、增强机体免疫等功能^[1]。因此，蚯蚓提取物作为一种潜在的新型饲料添加剂，具有较高的研究价值。目前用蚯蚓粉替代鱼粉饲喂育肥猪、肉鸡以及大鳞副泥鳅的研究已有报道^[2-4]，但其对动物生理效应的影响还缺乏完善的评价。同时，使用蚯蚓提取物作为饲料添加剂饲喂动物的研究报道较为罕见。本研究将不同浓度的蚯蚓提取物添加到小鼠的日常饲粮中，探究蚯蚓提取物对小鼠生长性能、血清生化指标、抗氧化指标、免疫指标的影响，以期为蚯蚓提取物应用于畜禽饲粮中提供一定的参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料及饲粮

蚯蚓提取物原料使用牛粪养殖的蚯蚓，由本实验室按照水提取的方式制备，其主要成分见表 1。基础饲粮为小鼠饲粮，购自成都达硕实验动物有限公司，其营养水平见表 2。

1.2 试验动物与设计

选用体重相近(12 g左右)、健康状况良好的清洁级雄性ICR断奶小鼠(21日龄)128只，随机分为4组，每组8个重复，每个重复4只小鼠。对照组饲喂基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂在基础饲粮中添加蚯蚓提取物的试验饲粮，按饲粮/蚯蚓液分别为1 g/5 μL、1 g/10 μL、1 g/15 μL的浓度添加蚯蚓提取物。室内温度为(23±2) ℃，相对湿度为60%~65%，光照周期12 h。自由采食、饮水。预试期7 d, 正试期28 d。

1.3 血样采集

试验第28天时，小鼠禁食不禁水15 h，每个重复随机取1只小鼠采血、处死。采集的血液促凝后室温静置，并收集上层血清，一部分立即用于血清常规生化指标的测定，另一部分-40 ℃保存用于血清其他相关指标的测定。

1.4 生长性能

试验第7、14、21、28天时，小鼠禁食不禁水15 h，称其空腹重，并以重复为单位，根据每周的给料量和剩料量，计算小鼠平均日采食量、平均日増重、料重比。

1.5 器官指数

采血后迅速解剖小鼠，采集心脏、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺，并用生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，称重，计算器官指数。

器官指数=[器官重(g)/空腹体重(g)]×1 000。

1.6 血清生化指标

使用血清生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)及尿素氮(UN)含量。

1.7 血清抗氧化指标

使用酶联免疫试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)。

1.8 血清免疫指标

使用抗菌肽检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清抗菌肽含量；使用酶联免疫试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)测定血清白细胞介素-6(IL-6)、免疫球蛋白G(IgG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(TNF-γ)含量。

1.9 数据统计分析

所有数据采用SAS 8.0进行统计分析，差异显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验, 结果以平均值±标准差表示，P < 0.05为差异显著。

2 结果 2.1 蚯蚓提取物对小鼠生长性能的影响

由表 3可以看出，各组小鼠的平均日采食量、平均日增重均无显著差异(P > 0.05)。试验Ⅰ组的料重比显著低于其余各组(P < 0.05)，较对照组降低了8.47%。

由表 4可以看出，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组心脏指数显著高于对照组(P < 0.05)，分别较对照组提高了13.21%、11.40%、12.18%，试验组间心脏指数无显著差异(P > 0.05)。各组间肾脏指数无显著差异(P > 0.05)。

2.2 蚯蚓提取物对小鼠血清生化指标的影响

由表 5可以看出，各组间血清葡萄糖、总蛋白及尿素氮含量无显著差异(P > 0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清葡萄糖含量比对照组分别降低了7.69%、10.42%、2.23%(P > 0.05)。各试验组血清总蛋白和尿素氮含量相较于对照组均呈现升高的趋势(P > 0.05)。

2.3 蚯蚓提取物对小鼠血清抗氧化指标的影响

由表 6可以看出，各试验组血清SOD活性相比对照组分别提高了27.67%、12.20%、11.19%，其中试验Ⅰ组显著高于对照组(P < 0.05)，各试验组间血清SOD活性差异不显著(P > 0.05)。各试验组血清T-AOC相较于对照组分别提高了34.62%、32.16%、5.12%，其中试验Ⅰ组和Ⅱ组显著高于对照组和试验Ⅲ组(P < 0.05)。

2.4 蚯蚓提取物对小鼠免疫指标的影响

由表 7可以看出，各试验组肝脏指数相较于对照组有所提高，但差异不显著(P > 0.05)。试验Ⅰ组脾脏指数显著高于试验Ⅱ组和对照组(P < 0.05)，其余各组间无显著差异(P > 0.05)。各组间胸腺指数无显著差异(P > 0.05)。

由表 8可以看出，试验Ⅰ组血清IgG、IFN-γ和IL-6含量显著高于对照组(P < 0.05)，分别提高了23.03%、19.65%、27.98%，除试验Ⅰ组外，各组间血清IgG、IFN-γ和IL-6含量无显著差异(P > 0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清溶菌酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，分别提高了9.93%、26.08%、35.40%。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清TNF-α含量显著高于对照组(P < 0.05)，分别提高了42.15%、62.04%、92.38%。

3 讨论 3.1 蚯蚓提取物对小鼠生长性能的影响

蚯蚓提取物具有丰富的营养成分，各种氨基酸比例平衡，富含7种必需氨基酸，能很好地互补饲粮中其他蛋白质源所缺乏的营养因子，是一种优质的动物性蛋白质饲料。张泳帧等^[2]发现，用蚯蚓粉替代育肥猪饲粮中5%的豆粕，总增重提高了14.75%，料重比降低了12.15%，显著提高育肥猪的生长性能。朱宇旌等^[3]将蚯蚓粉加入肉鸡饲粮中，结果表明与对照组相比，各阶段试验组的平均采食量和料重比显著降低，肉鸡的生长性能显著提高。孙朋朋等^[5]研究表明，仔猪的补充料中加入蚯蚓液，具有促进哺乳仔猪生长发育的作用，并提高仔猪的断奶重。本试验中各组小鼠的平均日采食量无显著差异，而料重比试验Ⅰ组较对照组降低了8.47%。同时，各试验组的心脏指数均显著高于对照组，说明蚯蚓提取物作为饲料添加剂对小鼠心脏的发育具有一定的促进作用，进而改善小鼠的新陈代谢功能，促进其生长。本试验结果表明，使用蚯蚓提取物作为饲料添加剂，在一定范围内能够显著提高小鼠的生长性能，并有效降低生产成本。

本试验中，与对照组相比，添加过高浓度蚯蚓提取物对小鼠平均日增重和料重比影响不显著，甚至呈现了一定程度的负效应，说明蚯蚓提取物添加浓度过高，会抑制小鼠对营养物质的消化和吸收，不利于其生长。此现象在过往研究中也有类似报道，Dedeke等^[6]用蚯蚓粉代替非洲鲶鱼饲粮中15%~50%的鱼粉，结果表明25%代替水平对平均日增重、增重率、特定生长率效应影响显著，但替代比例超过25%，增长速度显著放缓。Prayogi等^[7]将蚯蚓粉加入鹌鹑饲粮中，发现替代比例在10%可获得较高增重率，但在15%代替水平，其采食量显著减少，产生此类效应的具体作用机理有待进一步研究。

本研究认为，蚯蚓提取物之所以提高了小鼠的生长性能，原因可能有以下3点：1)研究采用的蚯蚓提取物提取自牛粪养殖的蚯蚓，其重金属的含量符合国家饲料卫生标准(GB 13078—2017)。经检测其粗蛋白质含量约占总量的7.4%，必需氨基酸含量占总量的42.8%，是一种营养丰富的饲料添加剂，对促进小鼠的摄食、生长及免疫有一定的促进作用；2)蚯蚓提取物含有丰富的酶，如纤维素酶、蛋白质水解酶、胆碱酯酶、超氧化物歧化酶等，可以在一定程度上帮助小鼠消化饲粮中的营养物质，提高饲料的利用率，并提高机体清除掉活性氧的能力；3)蚯蚓提取物含有丰富的小分子多肽、微量元素和维生素，能够提高小鼠的免疫力，进而促进小鼠摄食及生长。

3.2 蚯蚓提取物对小鼠血清生化指标的影响

血清生化指标的改变是机体新陈代谢机能发生改变的综合反映。本试验中，蚯蚓提取物对血清中的葡萄糖、总蛋白和尿素氮含量影响均不显著，表明蚯蚓提取物对机体糖代谢、氨基酸平衡等代谢过程均无负面影响。

3.3 蚯蚓提取物对小鼠血清抗氧化指标的影响

SOD是一种重要的抗氧化剂，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，能抵御超氧阴离子自由基对细胞的破坏。机体中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平，T-AOC的维持包括酶促和非酶促2个抗氧化体系，能够准确地反映出机体清除氧自由基的总体能力，也反映了机体清除活性氧的能力。蚯蚓提取物中含有丰富的SOD及过氧化氢酶。朱宇旌等^[3]在肉鸡饲粮中添加蚯蚓粉，结果显示试验组的血清SOD活性相对于对照组显著提高了35.70%。张泳帧等^[2]在生长猪饲粮中添加蚯蚓粉，结果显示与对照组相比，试验组的血清SOD活性提高了10.61%。范涛^[4]用蚯蚓粉代替鱼粉饲喂大鳞副泥鳅，结果显示试验组的血清T-AOC与对照组差异不显著，但血清SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性随着替代水平的升高而上升。本试验中各试验组的T-AOC及SOD活性相比对照组均有一定程度的上升，其中试验Ⅰ组的SOD活性相比对照组提高了27.67%，T-AOC相比对照组提高了34.62%，结果表明，使用蚯蚓提取物作为小鼠的饲料添加剂，能够显著增强小鼠机体的抗氧化能力。随着浓度的提高，小鼠血清中的SOD活性和T-AOC逐渐降低，这说明蚯蚓提取物对小鼠抗氧化能力的提升存在最佳吸收浓度，而非单一的浓度越高效果越好。这在过往研究中已有类似报道，周亿金等^[8]给成年小鼠灌服蚯蚓提取物，检测结果表明蚯蚓抗氧化提取物显著提高了成年小鼠血液及肝脏的SOD、过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px活性，但原浓度组抗氧化效果不及10倍稀释组。

3.4 蚯蚓提取物对小鼠免疫指标的影响

胸腺、脾脏及肝脏是小鼠最重要的免疫器官，免疫器官称重法是研究机体免疫状况的方法之一。一般认为免疫器官重量降低为免疫抑制所致，免疫器官重量增加则为免疫增强的表现^[9]。朱宇旌等^[3]在肉鸡饲粮中添加蚯蚓粉，结果表明2%蚯蚓粉与3%鱼粉共同作用能显著提高肉鸡免疫器官指数，但单独添加蚯蚓粉或鱼粉免疫器官指数提高不显著。本试验中，试验Ⅰ组脾脏指数显著高于对照组。脾脏属于外周免疫器官，是淋巴系统中最大的器官。脾脏的发育状况关系到体液和细胞免疫功能是否正常发挥。本研究表明，蚯蚓提取物在一定添加范围内对小鼠免疫器官的发育具有一定的促进作用，进而增强动物机体的免疫功能。

有关蚯蚓提取物对小鼠免疫指标影响的研究报道较少。张绍章等^[10]报道，蚯蚓提取物可以促进小鼠B淋巴细胞的增殖与分化，进而促使小鼠的特异性体液免疫功能显著增强。本试验中，试验Ⅰ组血清IgG、IFN-γ和IL-6含量显著高于对照组。IgG是血清中主要的抗体组成成分，是含量最高的免疫球蛋白种类，其含量的高低是衡量机体免疫状况的重要指标。IFN-γ是Ⅰ型辅助T细胞的标志性的细胞因子，能够激活抗原提呈细胞，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能，同时能够诱导神经元分化并抑制细胞凋亡。本研究表明，在一定范围内，蚯蚓提取物不仅能够增强小鼠的体液免疫，还能提升细胞免疫。随着蚯蚓提取物浓度的提高，小鼠血清中IgG、IFN-γ和IL-6含量逐渐降低，这说明蚯蚓提取物对小鼠免疫水平的提升存在最佳吸收浓度。之所以产生这样的效果，可能是蚯蚓提取物中丰富的氨基酸发挥的作用。氨基酸除参与蛋白质合成外，还具有调控机体免疫的作用，已有研究报道精氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等具有促进免疫器官的发育、淋巴细胞的增殖、抵抗病菌感染等作用，从而提高动物的免疫机能^[11]。同时，提高效果存在最适范围，超过一定的范围则起到相反的作用。Moghaddam等^[12]研究不同剂量苏氨酸对鸡细胞免疫和体液免疫的影响，结果表明饲喂NRC(1994)标准0.07%的苏氨酸可以提高鸡IgG的滴度，而饲喂高于NRC(1994)标准0.14%、0.31%的苏氨酸则是相反作用。

本试验中，试验组血清溶菌酶活性和TNF-α含量均显著高于对照组，且存在显著的剂量依赖性。溶菌酶是血清中重要的非特异性免疫因子，参与机体多种免疫反应，高水平的溶菌酶活性表明吞噬细胞处于较高活化状态，机体的抗菌防御机能较强。本研究结果表明蚯蚓提取物能显著增强小鼠的非特异性免疫。TNF-α能够杀伤或抑制肿瘤细胞，同时还有抗感染以及促进细胞增殖和分化的作用。林少琴等^[13]从蚯蚓组织中分离纯化到一种抗小鼠肝癌H22的糖蛋白。韩立军^[14]用蚯蚓提取物进行S-180肉瘤细胞体内、体外的抑制试验，结果显示其具有较好的抑制效果。本研究表明，蚯蚓提取物能够显著提高小鼠机体的TNF-α分泌，其抗肿瘤效果具有潜在开发价值。

4 结论

在小鼠基础饲粮中添加适量的蚯蚓提取物可提高小鼠的生长性能，降低料重比，同时调节血清抗氧化能力和免疫能力，以饲粮/蚯蚓液为1 g/5 μL的添加浓度效果最好。