梅山猪原产于中国上海嘉定、江苏太仓等地区，是太湖猪的一个品系。梅山猪具有性成熟早、繁殖力高、环境适应能力强、耐粗饲、肉质鲜美等优良特性。此外，由于猪内脏器官的生理结构与人类非常接近，其亦是很好的人类异种器官移植材料。目前，通过梅山猪的体细胞核移植技术进行梅山猪的克隆已经取得突破[1]。梅山猪还可作为很好的人类疾病的模式动物[2]。
低初生重是导致新生仔猪死亡的最主要原因之一[3]。人类临床研究亦表明，无论什么原因导致的婴儿低初生重都会严重损害新生儿的免疫功能[4]。研究表明，产仔数≤5头，窝内仔猪初生重变异系数最小，仔猪均匀度最好；而产仔数≥16头，窝内仔猪初生重变异系数最大，仔猪均匀度最差[5]。梅山猪繁殖能力极强，每窝产仔数平均可达16头，每窝猪平均有3~4头为低初生重仔猪。在生产中，低初生重的梅山仔猪由于成活率低，往往会被淘汰，不被淘汰的低初生重仔猪也会生长缓慢，这与低初生重的“杜×长×大”三元杂交仔猪的研究结果[6]相一致。而初生重对仔猪免疫功能影响的作用机制尚不清楚。有研究表明，梅山猪对肺炎支原体敏感性高，极易感染[7]。也有报道认为，梅山猪的抗病力较强[8]。有关梅山猪的免疫功能及其内在的调控机制，目前尚无系统研究。
本试验以不同初生重的梅山仔猪作为切入点，研究初生重对新生梅山仔猪免疫功能的影响，旨在为低初生重梅山猪的饲养管理提供理论支持；通过研究地方猪种梅山猪的免疫特性，为其更好地作为人类医学模型提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用梅山猪来自昆山市梅山猪保种有限公司。
1.2 试验设计选取胎次、预产期相近的梅山母猪6头，分娩后分别从每窝中挑选1对正常初生重和低初生重仔猪，共计6对。12头新生仔猪出生后不喂食母乳，出生6 h内在颈部肌肉注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)麻醉[9]，然后颈动脉放血致死。
1.3 检测指标试验仔猪心脏采血，取胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结并测定其重量; 采用流式细胞技术分析血液和脾脏组织中T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+和CD8+)比例；胸腺、脾脏、肠系膜淋巴结置液氮中保存，用于测定免疫相关基因的表达量。
1.3.1 T淋巴细胞亚群比例参照Dong等[10]的方法，分别取100 μL肝素钠抗凝血于2个试管中，分别加入10 μL鼠抗猪的CD3ε-PE(BB23-8E6-8C8，BD生物科技有限公司，美国)、10 μL鼠抗猪的CD4a-Alexa Fluor(74-12-4，BD生物科技有限公司，美国)抗体和10 μL鼠抗猪的CD8a-FITC(76-2-11，BD生物科技有限公司，美国)。4 ℃避光孵育30 min后分别加入3 mL红细胞裂解液，室温避光孵育10 min。然后4 ℃、1 200 r/min离心10 min，弃去上清，上流式细胞仪(CyAn ADP7，BD生物科技有限公司，美国)检测T淋巴细胞占全血总淋巴细胞的比例，CD3+ T淋巴细胞占T淋巴细胞的比例，以及CD4+和CD8+ T淋巴细胞分别占CD3+ T淋巴细胞的比例，结果采用Cell Qust Pro软件分析。
将部分脾脏组织剪碎，置于300目(孔径300 μm)尼龙网上，用一次性注射器的针芯研磨，边磨边加生理盐水2~3 mL，灭菌的平皿收集尼龙网下的液体。然后4 ℃、1 000 r/min离心8 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4，0.01 mol/L)洗2次。分别取100 μL的脾脏细胞加入到2个试管中，分别加入10 μL鼠抗猪的CD3ε-PE(BB23-8E6-8C8，BD生物科技有限公司，美国)、10 μL鼠抗猪的CD4a-Alexa Fluor(74-12-4，BD生物科技有限公司，美国)抗体和10 μL鼠抗猪的CD8a-FITC(76-2-11，BD生物科技有限公司，美国)。4 ℃避光孵育15 min后上流式细胞仪(CyAn ADP7，BD生物科技有限公司，美国)检测T淋巴细胞占全血总淋巴细胞的比例，CD3+ T淋巴细胞占T淋巴细胞的比例，以及CD4+和CD8+ T淋巴细胞分别占CD3+ T淋巴细胞的比例，结果采用Cell Qust Pro软件分析。
1.3.2 CD8和细胞因子的基因表达具体操作方法见参考文献[11]。特异性引物由英潍捷基(Invitrogen)(上海)贸易有限公司设计并合成(表 1)。制作标准曲线，分别计算内参基因和目的基因的扩增效率，发现扩增效率在90%~110%。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，以LBW组目的基因表达量为基准，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量[12]。未特别说明的试剂均购于宝生物工程(大连)有限公司。
|
表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
试验数据经Excel 2013初步处理后，采用SPSS 19.0软件对数据进行独立样本t检验，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 初生重对新生梅山仔猪免疫器官发育的影响由表 2可知，LBW组新生梅山仔猪的体重、脾脏重和相对脾脏重均显著低于NBW组(P < 0.05)。
|
|
表 2 初生重对新生梅山仔猪免疫器官重量的影响 Table 2 Effects of birth weight on weight of immune organs of Meishan newborn piglets |
由表 3可知，LBW组新生梅山仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+均极显著低于NBW组(P < 0.01)，CD8+ T淋巴细胞比例极显著高于NBW组(P < 0.01)。
|
|
表 3 初生重对新生梅山仔猪血液中T淋巴细胞亚群比例的影响 Table 3 Effects of birth weight on T lymphocyte subsets proportion in blood of Meishan newborn piglets |
由表 4可知，LBW组新生梅山仔猪脾脏中T淋巴细胞比例极显著低于NBW组(P < 0.01)，CD3+ T淋巴细胞比例极显著高于NBW组(P < 0.01)。
|
|
表 4 初生重对新生梅山仔猪脾脏中T淋巴细胞亚群比例的影响 Table 4 Effects of birth weight on T lymphocyte subsets proportion in spleen of Meishan newborn piglets |
由表 5可知，LBW组新生梅山仔猪胸腺中白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)的基因相对表达量极显著低于NBW组(P < 0.01)。
|
|
表 5 初生重对新生梅山仔猪胸腺中CD8和细胞因子基因相对表达量的影响 Table 5 Effects of birth weight on relative gene expression levels of CD8 and cytokines in thymus of Meishan newborn piglets |
由表 6可知，LBW组新生梅山仔猪脾脏中CD8、IL-2、IL-4和干扰素-γ(IFN-γ)的基因相对表达量均极显著高于NBW组(P < 0.01)。
|
|
表 6 初生重对新生梅山仔猪脾脏中CD8和细胞因子基因相对表达量的影响 Table 6 Effects of birth weight on relative gene expression levels of CD8 and cytokines in spleen of Meishan newborn piglets |
由表 7可知，LBW组新生梅山仔猪肠系膜淋巴结中CD8的基因相对表达量显著高于NBW组(P < 0.05)，IL-2、IL-4和IFN-γ的基因相对表达量极显著高于NBW组(P < 0.01)。
|
|
表 7 初生重对新生梅山仔猪肠系膜淋巴结中CD8和细胞因子基因相对表达量的影响 Table 7 Effects of birth weight on relative gene expression levels of CD8 and cytokines in mesenteric lymph nodes of Meishan newborn piglets |
胸腺和脾脏是重要的免疫器官，胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素，主要参与细胞免疫；脾脏中分布有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，与体液免疫紧密相关。肠系膜淋巴结参与肠道黏膜免疫反应。这些免疫器官或组织的重量及相对重量都在一定程度上反映其功能及其中免疫细胞的数量[13]。本研究结果发现，LBW组新生梅山仔猪的脾脏重和相对脾脏重均显著低于NBW组，提示LBW新生梅山仔猪的脾脏免疫功能可能低于NBW新生梅山仔猪。本课题组在“杜×长×大”三元杂交LBW仔猪上的研究发现，子宫内发育迟缓(IUGR)新生仔猪的胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结相对重量均显著低于NBW新生仔猪，与本文结果相似，但又不完全一致，这可能与动物品种不同有关[14]。对于梅山猪而言，低初生重对其脾脏的影响最大，对其他免疫器官的影响相对较小；而对于“杜×长×大”三元杂交猪而言，低初生重对其所有免疫器官的影响都很大。人类临床研究亦表明，无论什么原因导致的婴儿低初生重都会严重损害新生儿的免疫功能[4]。
3.2 初生重对新生梅山仔猪血液和脾脏中T淋巴细胞亚群的影响T淋巴细胞是参与机体免疫反应的重要功能性免疫细胞。细胞膜表面的CD3是T淋巴细胞成熟的表面标志，成熟的T淋巴细胞主要分为CD4和CD8 2个细胞亚群。CD4+ T淋巴细胞的主要功能亚群为辅助性T细胞1(Th1)，CD8+ T淋巴细胞的主要功能亚群为杀伤性T细胞2(Th2)，CD8+ T淋巴细胞亚群可通过分泌细胞因子抑制CD4+ T淋巴细胞亚群的功能[15]。当CD4+ T淋巴细胞功能低下或CD4+/CD8+低于正常值时，机体免疫力下降，易发生感染[16-17]。本研究结果发现，LBW组新生梅山仔猪血液中CD4+ T淋巴细胞亚群比例、CD4+/CD8+均极显著低于NBW组，CD8+ T淋巴细胞亚群比例极显著高于NBW组；LBW组新生梅山仔猪脾脏中T淋巴细胞比例极显著低于NBW组。这表明LBW新生梅山仔猪机体免疫力较低，易发生感染。本课题组在“杜×长×大”三元杂交低初生重仔猪上的研究发现，IUGR新生仔猪血液和脾脏中CD8+ T淋巴细胞亚群比例均显著高于NBW新生仔猪，与本试验结果相似[10]。以上结果提示，CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的数量及其比值可能可以作为判断仔猪机体免疫功能的一个重要指标，相对于细胞因子等指标的个体差异大，T淋巴细胞亚群这一指标似乎更为稳定。
3.3 初生重对新生梅山仔猪免疫相关组织中CD8和细胞因子基因表达的影响IL-2属于Th1型细胞因子，可促进B细胞和自然杀伤(NK)细胞的增殖、细胞因子的释放及抗体的生成，与白细胞介素-12(IL-12)协同作用诱导IFN-γ的产生，起到抗肿瘤的作用[18]。IL-4是Th2的特殊细胞因子，对由细胞因子网络向Th1偏移引起的炎症、移植排斥等疾病有抑制作用，对白血病、肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病有治疗作用[19]。本研究结果发现，LBW组新生梅山仔猪胸腺中IL-2和IL-4的基因相对表达量极显著低于NBW组，提示LBW新生梅山仔猪机体免疫功能下降，与本试验T淋巴细胞亚群结果一致。LBW组新生梅山仔猪脾脏和肠系膜淋巴结中CD8、IL-2、IL-4和IFN-γ的基因相对表达量均显著高于NBW组。由于CD4基因表达量太低，未能成功检测出。LBW组新生梅山仔猪脾脏和肠系膜淋巴结中CD8的基因表达量提高，与T淋巴细胞亚群结果一致。脾脏和肠系膜淋巴结中IL-2、IL-4和IFN-γ基因表达量提高，这与预期结果不一致，原因还有待进一步研究。
4 结论LBW组新生梅山仔猪的体重、脾脏重、相对脾脏重显著低于NBW组；血液中CD4+ T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+及脾脏中T淋巴细胞比例极显著低于NBW组，血液中CD8+及脾脏中CD3+ T淋巴细胞比例极显著高于NBW组；胸腺中IL-2和IL-4的基因相对表达量极显著低于NBW组，脾脏和肠系膜淋巴结中CD8、IL-2、IL-4和IFN-γ的基因相对表达量显著高于NBW组。以上结果提示，LBW新生梅山仔猪的免疫功能低于NBW新生梅山仔猪，这与其体内T淋巴细胞分化和功能改变有关。
| [1] |
华再东, 郑新民, 魏庆信, 等. 体细胞核移植生产梅山猪[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(10): 192-197. |
| [2] |
陈思, 罗光彬, 王辉田, 等. 猪体细胞核移植的影响因素[J]. 猪业科学, 2014, 31(2): 98-100. DOI:10.3969/j.issn.1673-5358.2014.02.034 |
| [3] |
LE DIVIDICH J, CHARNECA R, THOMAS F. Relationship between birth order, birth weight, colostrum intake, acquisition of passive immunity and pre-weaning mortality of piglets[J]. Spanish Journal of Agricultural Research, 2017, 15(2): e0603. DOI:10.5424/sjar/2017152-9921 |
| [4] |
CHANDRA R K, MATSUMURA T. Developmental aspects of cell-mediated immunity and findings in low birth weight infants[J]. The Indian Journal of Pediatrics, 1980, 47(2): 103-107. DOI:10.1007/BF02822870 |
| [5] |
施辉毕, 王立刚, 梁晶, 等. 仔猪均匀度遗传参数估计及影响因素分析[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(12): 2146-2152. |
| [6] |
董丽.IUGR仔猪肠道黏膜免疫特性及丁酸衍生物对其调节作用研究[D].博士学位论文.南京: 南京农业大学, 2015.
|
| [7] |
方晓敏, 赵为民, 付言峰, 等. 猪支原体肺炎发生的品种敏感差异及分子基础[J]. 中国农业科学, 2015, 48(14): 2839-2847. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.015 |
| [8] |
禚艳书, 刘铁铮, 王红玲, 等. 梅山猪多产性能的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2005, 32(10): 29-31. DOI:10.3969/j.issn.1671-7236.2005.10.013 |
| [9] |
王远孝.IUGR猪的生长与肠道发育及L-精氨酸和大豆卵磷脂的营养调控研究[D].博士学位论文.南京: 南京农业大学, 2011.
|
| [10] |
DONG L, ZHONG X, ZHANG L L, et al. Impaired intestinal mucosal immunity is associated with the imbalance of T lymphocyte sub-populations in intrauterine growth-restricted neonatal piglets[J]. Immunobiology, 2015, 220(6): 775-781. DOI:10.1016/j.imbio.2014.12.017 |
| [11] |
钟翔.Hsp70介导IUGR仔猪早期免疫功能损伤的机理及谷氨酰胺的营养调控研究[D].博士学位论文.南京: 南京农业大学, 2010.
|
| [12] |
LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. DOI:10.1006/meth.2001.1262 |
| [13] |
冯会红, 李萌萌, 牛云锋, 等. 金莲花水提液对免疫抑制小鼠应激反应和免疫器官的影响[J]. 华北煤炭医学院学报, 2011, 13(6): 740-741. DOI:10.3969/j.issn.1008-6633.2011.06.006 |
| [14] |
DONG L, ZHONG X, AHMAD H, et al. Intrauterine growth restriction impairs small intestinal mucosal immunity in neonatal piglets[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 2014, 62(7): 510-518. |
| [15] |
HASKINS K, COOKE A. CD4 T cells and their antigens in the pathogenesis of autoimmune diabetes[J]. Current Opinion in Immunology, 2011, 23(6): 739-745. DOI:10.1016/j.coi.2011.08.004 |
| [16] |
严健, 原永明, 张舒, 等. CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群在肿瘤患者外周血中检测的临床意义[J]. 检验医学, 2013, 28(10): 901-903. |
| [17] |
杨蕾, 庄芸, 钱锡峰, 等. 老年免疫性血小板减少症患者外周血T淋巴细胞亚群检测及其临床意义[J]. 临床血液学杂志, 2015, 28(3): 384-388, 391. |
| [18] |
KOGUT M, ROTHWELL L, KAISER P. Differential effects of age on chicken heterophil functional activation by recombinant chicken interleukin-2[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2002, 26(9): 817-830. |
| [19] |
李睿. 白细胞介素-4的研究进展[J]. 华北煤炭医学院学报, 2011, 13(3): 329-332. DOI:10.3969/j.issn.1008-6633.2011.03.018 |