断奶是仔猪出生后面临的最大应激，饲粮与环境的改变最终导致仔猪在断奶后采食量降低、负增重、免疫力降低和发病率升高等问题，严重的甚至死亡^[1]，其实质则是仔猪肠道损伤、肠道结构和功能发生改变。而仔猪肠道不仅是机体最大的消化器官，更是机体的免疫器官，还是阻挡病原菌入侵的首要屏障^[2]，肠道正常的形态结构对维持动物机体的消化和免疫功能至关重要。小肠中钠/葡萄糖共转运载体1(sodim-gluose transporter 1，SGLT1)和二肽转运载体1(peptidetransporter 1，PepT1)分别是转运葡萄糖和寡肽的载体，反映动物机体消化吸收碳水化合物和蛋白质的功能^[3-4]。因而研究仔猪断奶前及断奶后1周内血清生化指标、肠道形态及SGLT1和PepT1基因的表达具有非常重要的意义。关于SGLT1、PepT1基因的研究，多集中在其组织分布、功能及表达调控^[5-6], 但针对仔猪断奶前后表达规律，特别是仔猪断奶后1周内的生理变化及相关基因的表达规律研究的较少。因此，本试验旨在研究仔猪在断奶前及断奶后1周内血清生化指标、肠道形态结构及空肠SGLT1和PepT1基因表达差异，为研究仔猪断奶营养调控技术及缓解仔猪断奶应激提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验分组与试验动物

选取20日龄健康仔猪55头，断奶前1天屠宰5头，余下50头仔猪在21日龄分成5组(圈)进行断奶，每组10头仔猪，饲喂常规玉米-豆粕型基础教槽料，日饲喂4次，时间分别为07:00、11:00、15:00和21:00，每次以吃饱后食槽中略有余料为度，自由饮水。观察猪只健康状况和清扫猪圈。分别在断奶后第2、4和8天从每个圈挑选1头体重接近的仔猪采血后屠宰，即每次屠宰5头仔猪。测定仔猪血清生化指标、十二指肠形态结构以及空肠中SGLT1和PepT1基因表达量，探讨断奶前及断奶后1周内仔猪生理指标变化差异及机理。

1.2 测定指标与方法 1.2.1 血清生化指标测定

试验第1、2、4、8天，屠宰仔猪前空腹采集静脉血8 mL，在4 ℃冰箱中静置6 h，然后3 000 r/min离心15 min，制备血清，-20 ℃保存，测定血清碱性磷酸酶(ALP)活性及钠、氯、钾、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量，采用日立7600-020全自动分析仪(日立高科技公司，日本)测定，所有血清指标委托郑州市颐和医院检验科检测。

1.2.2 小肠黏膜形态结构测定

试验第1、2、4、8天，分别取每头仔猪十二指肠中部2 cm的肠段，放入4%甲醛溶液中固定，经水洗、透明、浸蜡、包埋等处理后，在室温下切成5 μm厚的切片，用于形态结构观察。100倍显微镜下用标尺测量20根最长绒毛和相应的隐窝深度。绒毛高度以肠腺开口至绒毛顶端的垂直高度为准，隐窝深度为绒毛根部上皮凹陷到固有层的距离，并计算绒毛长度与隐窝深度比值(V/C)。

1.2.3 空肠中SGLT1和PepT1基因表达量的测定

每头仔猪屠宰时取空肠前端2 cm左右的肠段，剪碎后用含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，装入无RNA酶的1.5 mL的EP管中，迅速在液氮中冷冻，-70 ℃保存。采用实时荧光定量PCR测定空肠中SGLT1和PepT1基因表达量。

每头仔猪取100 mg空肠样品在液氮中充分研磨，收集于1.5 mL的EP管中，用RNA提取试剂盒(SK1312，上海生工)提取总RNA，用cDNA试剂盒(SK2445，上海生工)以提取的总RNA为模板进行RT反应，然后立即进行实时荧光定量PCR反应。SGLT1、PepT1基因和内参基因β-肌动蛋白(β-actin)引物均由上海生工设计并合成，引物序列见表 1。反应体系如下：cDNA 2 μL，SYBR Green Real time PCR Master Mix 10 μL，上游、下游引物各1 μL，0.1% DEPC处理水6 μL。实时荧光定量PCR反应程序如下：95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 30 s进行40个循环，最后70 ℃延伸5 min。分别测定目的基因和内参基因的Ct值，用2^-ΔΔCt方法计算各基因表达量。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件对断奶前和断奶后1周内的数据进行方差分析和Duncan氏多重比较。试验结果用平均值±标准差表示。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 仔猪断奶后1周内血清生化指标的变化规律

由表 2可知，与断奶前相比，血清碱性磷酸酶活性在断奶后第2天显著降低(P < 0.05)，在断奶后第8天极显著降低(P < 0.01)，血清钾离子含量在断奶后第4和8天显著增加(P < 0.05)，血清尿素氮含量在断奶后第2天极显著增加(P < 0.01)，在断奶后第8天又显著降低(P < 0.05)，血清免疫球蛋白G含量断奶后均显著降低(P < 0.05)。其他指标在断奶前后无显著差异(P>0.05)。

2.2 仔猪断奶后1周内十二指肠形态结构的变化规律

由图 1和表 3可知，和断奶前相比，十二指肠绒毛高度在断奶后第2天极显著降低(P < 0.01)，在断奶后第4天显著降低(P < 0.05)，隐窝深度在断奶后第2和4天均显著增加(P < 0.05)，V/C在断奶后第2和4天均显著降低(P < 0.05)。

2.3 仔猪断奶后1周内空肠SGLT1和PepT1基因表达量的变化规律

由表 4可知，与断奶前相比，仔猪空肠中SGLT1基因表达量在断奶后均显著降低(P < 0.05)，PepT1基因表达量在断奶后第4和8天均显著降低(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 仔猪断奶后1周内血清生化指标的变化规律

机体血液指标可反映动物生理机能和健康状况，有研究表明仔猪断奶会导致仔猪血液指标的变化^[7]。朱孟玲等^[8]选取5日龄断奶的小梅山仔猪和长梅仔猪，分别于断奶时、断奶后1、3和5 d测定血清生化指标，发现断奶后血清中白蛋白、球蛋白含量显著降低。本试验结果表明，断奶后血清球蛋白含量也降低，但没有达到显著的水平，说明断奶应激对仔猪免疫功能有一定的影响。本试验还发现，血清碱性磷酸酶活性在断奶前最高，断奶后第2和8天显著或极显著降低，这与朱孟玲等^[8]的研究结果不一致，他们发现血清碱性磷酸酶活性在不同品系中的结果不一，即纯种猪，断奶应激对血清碱性磷酸酶活性无显著影响，而在杂交仔猪中，断奶后血清中其活性显著上升。Melo等^[9]最新研究表明，小肠碱性磷酸酶可抑制肠道菌群移位及炎症产生，进而有利用仔猪肠道健康。Lackeyram等^[10]在断奶仔猪上的研究表明，断奶可降低碱性磷酸酶蛋白表达量和碱性磷酸酶活性，这间接表明碱性磷酸酶可促进肠道健康，提高养分的吸收利用率。而本试验结果也表明了断奶对仔猪肠道健康有一定的危害。造成结果不一致的原因可能在于猪的品种、年龄及所用的饲粮类型不同。血清尿素氮含量反映了蛋白质吸收的效率，可以准确地反映动物机体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况^[11]，氨基酸平衡良好时，尿素氮含量下降，尿素氮含量越低则说明氮的利用率越高。本试验中，断奶后第2天血清尿素氮含量最高，表明蛋白质的消化吸收最差。

3.2 仔猪断奶后1周内十二指肠形态结构的变化规律

小肠是营养物质吸收利用的主要场所，肠绒毛高度和隐窝深度反映小肠的功能状态，绒毛高度越高，隐窝深度越浅越利于饲粮中营养物质的吸收。断奶应激使得仔猪采食量下降和营养缺乏，进而导致肠道的结构和功能受损，主要表现为断奶后肠道绒毛萎缩和隐窝增生^[12]。

任曼等^[13]测定了仔猪21日龄断奶及断奶后14 d十二指肠和空肠的绒毛高度和隐窝深度，发现断奶后14 d的十二指肠绒毛高度显著增加，隐窝深度无显著差异。但他们没有测断奶后1周内仔猪肠道结构的变化。Tang等^[14]的研究结果表明，和断奶前相比，断奶后3 d小肠绒毛及V/C极显著降低，隐窝深度极显著增加。Cera等^[15]早期的研究结果也表明，断奶后第3天绒毛高度比断奶时下降65.3%，这与本试验研究结果较为一致，本试验结果表明，十二指肠绒毛高度在断奶后第2天极显著降低，断奶后第4天显著降低，隐窝深度在断奶后第2和4天均显著增加，V/C在断奶后第2和4天均显著降低。小肠绒毛高度及隐窝深度的改变影响机体能量和蛋白质代谢^[16]。

3.3 仔猪断奶后1周内相关功能基因表达的变化规律

SGLT1位于小肠上皮刷状缘膜表面，是主动转运葡萄糖进入小肠上皮细胞内部的关键载体^[17]。研究表明，SGLT1的表达决定小肠转运葡萄糖的效率^[18]。研究表明，SGLT1在整个哺乳期保持较高水平，断奶后显著下降^[19]。张磊等^[20]比较了新淮猪在断奶前1周、断奶后3 d、断奶后1周和断奶后10 d空肠中SGLT1基因表达的变化情况，发现断奶后3 d SGLT1基因表达量和断奶前及断奶当天差异不显著，但在断奶后第7天显著降低，比断奶前下降了49.3%，断奶后第10天虽然有所增加，但仍显著低于断奶前、断奶当天及断奶后第3天时的表达量。本试验结果表明，仔猪空肠中SGLT1基因表达量在断奶前显著高于断奶后的第2、4和8天，SGLT1基因表达量在断奶后第2天就显著下降，而张磊等^[20]的研究结果表明SGLT1基因表达量在断奶1周后才开始下降。张帅等^[21]在断奶仔猪上的研究表明，空肠中SGLT1基因表达量在断奶后先降低，断奶后第3天开始升高。造成这些结果不一致的原因可能在于所选猪的品种、测定的日龄以及环境不同所致，但研究结果均表明了仔猪断奶后SGLT1基因表达量会显著降低，这也就阐明了仔猪断奶后1周内糖代谢水平显著下降的机理所在。

饲粮蛋白质在肠道的主要消化产物是游离氨基酸和寡肽(二肽和三肽)，PepT1基因主要在消化道中表达，对寡肽的吸收起关键性作用。邹仕庚等^[22]分别测定了1、7、26、30、60、90和150日龄蓝塘和长白猪肠道PepT1基因表达量，发现2品种猪空肠中PepT1基因表达量在30日龄即断奶后第2天最低，显著低于断奶前(26日龄)和60日龄仔猪，说明断奶可显著降低PepT1基因表达量。本研究结果也表明，仔猪断奶后第2天PepT1基因表达量最低，表明断奶也影响机体蛋白质代谢。最近的研究表明PepT1可通过调控小肠隐窝-绒毛轴而维持肠道健康^[23]，进一步证实了仔猪断奶后PepT1基因表达量降低，对肠道健康有负面影响。

4 结论

本试验结果表明了断奶1周内对仔猪生理机能造成了一定的应激，降低了仔猪血清中免疫球蛋白G含量，改变了仔猪十二指肠形态结构，降低了空肠中SGLT1和PepT1基因表达量，尤其以断奶后第2和4天应激最强。