, GUO Ran
, LI Xuehe, ZHANG Yu, LU Jingjing, YANG Pinxian, XIA Hui, WANG Xiaoming, JING Bingyan, GONG Chunguang
脂类可以为动物提供所需的必需脂肪酸和能量，还能够起到调节动物机体免疫的作用[1]。适量脂肪供应不仅能够节约蛋白质，减少环境污染，同时还可降低饲料成本[2]。豆油含有多种不饱和脂肪酸，是饲料中重要的原料。水产养殖业迅速的发展导致了饲料中豆油的用量越来越大，价格也随之大幅攀升[3]。豆油的供给是有限的，并且存在着过量消耗，为了降低水产养殖对豆油的过度依赖，人们开展了有关各种脂肪源替代油脂的研究[4]。因此如何降低饲料配方中脂肪成本成为饲料工业中亟待解决的任务[5]。
脂肪酸钙的原料主要是动植物油脂，根据脂肪酸链的长短不同而异，主要品种有异丁酸钙、异戊酸钙、辛酸钙、葵酸钙、棕榈油脂肪酸钙、硬脂酸钙等。近年来未见脂肪酸钙在水产饲料中应用的研究报道，脂肪酸钙在反刍动物中应用比较广泛。大量研究证明，反刍动物饲粮中添加植物性脂肪酸钙能够提高动物生产性能[6]；既可避免对瘤胃微生物的影响、提高饲料消化率，又可使脂肪酸得以有效的利用[7]；还可以提高饲粮中的能量水平，降低饲料的精粗比，从而降低饲料成本，提高经济效益[8]。脂肪酸钙储存方便、价格低，是替代豆油的理想产品，在水产领域对脂肪酸钙的产品开发和应用研究将是我国饲料添加剂研究的重点方向之一[9]。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)原产于南太平洋沿岸的暖水水域，具有生长快、营养丰富、产量大的特点。养殖成本较高的问题是困扰养殖户的一个难题，在集约化养殖中凡纳滨对虾饲料成本占总养殖成本的50%~60%[10]，这也是制约水产养殖业进一步发展的瓶颈。近年来，虾类营养学家对其营养需求量和健康免疫[11]等方面进行了广泛的研究，但未见脂肪酸钙在凡纳滨对虾饲料中应用的研究报道。凡纳滨对虾的必需脂肪酸有亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)[12]。因此，本试验利用饱和脂肪酸钙和不饱和脂肪酸钙完全替代豆油研究其对凡纳滨对虾生长性能、体成分、免疫和代谢指标的影响，旨在为饱和脂肪酸钙和不饱和脂肪酸钙在凡纳滨对虾饲料中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验饲料以鱼粉、虾粉、豆粕、花生粕为蛋白质源，以鱼油、豆油为脂肪源，以饱和脂肪酸钙和不饱和脂肪酸钙为脂肪源完全替代豆油，配制3种等氮等能试验饲料，分别为基础饲料(D1)、不饱和脂肪酸钙替代豆油饲料(D2)和饱和脂肪酸钙替代豆油饲料(D3)，其组成及营养水平见表 1，脂肪酸钙脂肪酸组成见表 2，饲料脂肪酸组成见表 3。试验所需的各种原料粉碎后过80目筛，并按照配方的比例进行混合，其中三氧化二钇要采用逐级扩大法均匀混合。利用F-26双螺杆压条机做成直径1.5 mm的颗粒料，放置在烘箱中60 ℃干燥30 min，风干后放入-20 ℃冰柜中保存。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
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表 2 脂肪酸钙脂肪酸组成(干物质基础) Table 2 Fatty acid composition of fatty acid calcium (DM basis) |
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表 3 试验饲料脂肪酸组成 Table 3 Fatty acid composition of experimental diets |
试验用的凡纳滨对虾来自海南禄泰海洋生物科技有限公司，是进口凡纳滨对虾自交系F1代虾苗。凡纳滨对虾先在水族箱中暂养1周，投喂商业饲料。随后选取体质健壮、大小均匀、体重为(0.30±0.02) g的虾苗360尾，随机分为3组，分别饲喂3种试验饲料，每组3个重复，每个重复40尾虾，试验进行56 d后结束。
试验是在室内循环水族箱(60 cm×40 cm×50 cm)中饲养的，每箱放养40尾虾，一共9个箱。试验用水是经过滤的天然海水，其盐度为(29±1)‰。饲料每天投喂3次(分别在08:00、14:00、20:00)，投喂量为虾体总重的6%~10%，投喂2 h后用虹吸的方法清除粪便[13-14]，每天换水量为箱体的1/3。整个试验过程中24 h增氧，每天测定水温，每2周检测水体的pH、氨氮浓度。整个试验过程中水体温度为(27±1) ℃，溶氧量浓度为(7.3±0.3) mg/L，氨氮浓度为(0.51±0.12) mg/L，pH为8.0~8.5。
1.3 样品采集试验开始28 d后收集粪便，每次投喂饲料1 h后用吸管吸出新鲜、饱满、成型的粪便，放入-80 ℃冰箱中冷冻保存备测。试验结束时，将凡纳滨对虾空腹24 h，称取每个水族箱总重，并记录尾数。从每个水族箱中随机选出5尾虾，用纱布吸干表面水分称重，在105 ℃烘箱中烘干至恒重，用来制备全虾样品，用于体成分检测。另从每个水族箱随机选取空腹24 h的凡纳滨对虾15尾，用纱布吸干表面水分称重记录，从中选取4尾凡纳滨对虾抽血淋巴，沉淀离心测甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)的含量，另外11尾凡纳滨对虾抽血淋巴，放入-80 ℃冰箱冷冻保存，用于代谢酶活性及抗氧化指标的检测[15-17]，然后摘取这15尾凡纳滨对虾的肝胰腺并称重记录，放入-80 ℃冰箱冷冻保存，用于代谢酶活性和抗氧化指标及脂肪酸组成的检测，最后取这15尾凡纳滨对虾的肌肉，放入-80 ℃冰箱冷冻保存，用于体成分检测。
1.4 测定方法虾体和饲料常规成分分析参照AOAC(1995)法测定。水分含量采用烘箱烘干(105 ℃)失重法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(JK9830，济南精密科学仪器仪表有限公司)测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(以石油醚为溶剂)测定，粗灰分含量采用马弗炉灰化法(550 ℃，9 h)测定。肝胰腺和饲料中脂肪酸组成分析采用硫酸-甲醇脂化法，使用高效气相色谱仪(GC-2014，日本岛津公司)测定。
血淋巴、肝胰腺相关代谢酶活性和抗氧化指标检测均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，按照使用说明进行操作。胰蛋白酶(PRS)活性采用紫外比色法测定，淀粉酶(AMS)活性采用碘-淀粉比色法测定，酸性磷酸酶(ACP)活性采用连续检测法测定，碱性磷酸酶(AKP)活性采用连续监测法测定，谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)活性采用赖氏法测定，丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、谷胱甘肽S转移酶(GST)活性采用可见光法测定，苹果酸脱氢酶(MDH)活性采用紫外比色法测定，组织中蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定。血淋巴中GLU和TG含量由秦皇岛海港医院检验中心测定。
1.5 数据分析试验数据采用SPSS 19.0分析软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计，试验结果用平均值±标准差表示。单因素方差分析有显著性差异(P＜0.05)时，再采用Duncan氏法进行多重比较。
2 结果与分析 2.1 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾生长性能的影响由表 4可知，各组间凡纳滨对虾的增重率、存活率、特定生长率、肝体比均无显著性差异(P>0.05)；D1、D2组间饲料系数没有显著差异(P>0.05)，但D3组的饲料系数显著高于D1、D2组(P < 0.05)。
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表 4 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾生长性能的影响 Table 4 Effects of different fatty acid calcium on growth performance of Litopenaeus vannamei |
由表 5可知，各组间凡纳滨对虾全虾粗蛋白质、粗脂肪、水分含量及肌肉粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量均无显著差异(P>0.05)。D3组全虾的粗灰分含量显著高于D1、D2组(P < 0.05)。
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表 5 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾体成分的影响 Table 5 Effects of different fatty acid calcium on body composition of Litopenaeus vannamei |
由表 6可知，各组间干物质、粗蛋白质、粗脂肪表观消化率无显著差异(P>0.05)。
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表 6 不同脂肪酸钙对营养物质表观消化率的影响 Table 6 Effects of different fatty acid calcium on nutrient apparent digestibility |
由表 7、表 8可知，各组间凡纳滨对虾肝胰腺代谢酶中AMS、PRS、GOT和GPT活性均无显著差异(P>0.05)；各组间肝胰腺抗氧化指标中AKP与ACP活性、T-AOC、MDA含量均无显著差异(P>0.05)；D2、D3组肝胰腺GSH-Px活性显著低于D1组(P < 0.05)。
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表 7 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾肝胰腺中代谢酶活性的影响 Table 7 Effects of different fatty acid calcium on metabolic enzyme activities in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei |
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表 8 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标的影响 Table 8 Effects of different fatty acid calcium on antioxidant indexes in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei |
由表 9、表 10可知，D1组血淋巴MDH活性显著高于D3组(P<0.05)，D1组血淋巴MDH活性和D2组无显著差异(P>0.05)；各组间血淋巴GSH-Px、ACP、GST活性均无显著差异(P>0.05)；D3组血淋巴MDA含量显著高于D1、D2组(P<0.05)，D1、D2组间无显著差异(P>0.05)。
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表 9 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾血淋巴中苹果酸脱氢酶活性的影响 Table 9 Effects of different fatty acid calcium on MDH activity in haemolymph of Litopenaeus vannamei |
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表 10 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾血淋巴抗氧化指标的影响 Table 10 Effects of different fatty acid calcium on antioxidant indexes in hemolymph of Litopenaeus vannamei |
由表 11可知，各组间凡纳滨对虾血淋巴中TG含量无显著差异(P>0.05)；D3组血淋巴GLU含量显著高于D1、D2组(P<0.05)，D1、D2组间无显著差异(P>0.05)。
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表 11 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾血淋巴GLU、TG含量的影响 Table 11 Effects of different fatty acid calcium on GLU and TG contents in haemolymph of Litopenaeus vannamei |
由表 12可知，D3组肝胰腺中EPA+DHA含量低于其他各组，D2组中的DHA+EPA含量最高，但组间差异均不显著(P>0.05)。
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表 12 不同脂肪酸钙对凡纳滨对虾肝胰腺脂肪酸组成的影响 Table 12 Effects of different fatty acid calcium on fatty acid composition in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei |
本试验是利用饱和脂肪酸钙和不饱和脂肪酸钙完全替代饲料中豆油，结果表明各组间凡纳滨对虾的增重率、特定生长率、肝体比均无显著差异。林向东等[18]研究发现，不同油脂对凡纳滨对虾生长率、增重率均无显著影响，与本试验研究结果类似；吴纯衡[19]利用鳕鱼肝油作为脂肪源饲养斑节对虾，对其生长性能无显著影响；刘穗华等[20]研究表明利用植物油替代鱼油对凡纳滨对虾生长性能和肝体比没有显著影响。这表明本试验中D2、D3组油脂替代对凡纳滨对虾的生存是相对安全有保障的。本试验结果表明，各组间全虾粗蛋白质、粗脂肪、水分含量及肌肉粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分含量均无显著差异，而D3组全虾粗灰分含量显著高于D1、D2组，各组间肌肉的粗灰分含量没有显著差异，这可能是由于脂肪酸钙中的钙盐在对虾甲壳以及肝脏中沉积引起的。
3.2 不同脂肪酸钙替代豆油对凡纳滨对虾脂肪酸组成和营养物质表观消化率的影响本试验中，干物质表观消化率和粗蛋白质表观消化率各组间差异不显著，但是D1、D2组的脂肪表观消化率高于D3组，饱和脂肪酸钙更容易在对虾肝胰腺中累积脂肪从而引起脂肪表观消化率降低[21]。一些研究认为甲壳动物肝胰腺的超微结构与其营养状况密切相关[22-24]；Griffin等[25]研究发现十足目甲壳动物肝胰腺的主要功能是吸收和储存脂类，脂类主要储存于R细胞。本试验中，D3组的饲料系数显著高于D1、D2组，由于EPA具有降低胆固醇(CHO)和TG含量的作用，进而促进体内饱和脂肪酸代谢；DHA能阻止CHO在血管壁上的沉积[26]。EPA和DHA含量升高都会降低饲料消耗[18]，本试验中D1、D2组肝胰腺中EPA+DHA的含量高于D3组，导致D3组饲料系数高，D3、D2组的肝体比高于D1组。Stijkney等[27]和Lim等[28]发现投喂不同的脂肪源会影响鱼虾机体脂肪酸组成；季文娟[29]报道，从海捕和人工养殖对虾的脂肪酸的分析和差异可见，饵料中脂肪的脂肪酸组成对对虾脂肪酸组成有显著的影响，对对虾的生长也产生一定的影响，例如：虾场使用的人工合成饵料，原料成分中多含有豆饼粕、花生饼粕等含有较高亚油酸的饲料源，结果造成了养殖虾脂肪酸组成中含有较高量亚油酸、较低量DHA的特点，本试验和前人研究结果都表明了，脂肪源的不同会导致DHA含量的变化。
3.3 不同脂肪酸钙替代豆油对凡纳滨对虾代谢酶活性的影响各组间凡纳滨对虾肝胰腺中AMS、PRS、GOT、GPT活性都没有显著差异，说明脂肪酸钙的组成并不会影响淀粉的消化和蛋白质的代谢。推测饱和脂肪酸钙吸收后会降低血淋巴GLU的代谢，导致D2组血淋巴GLU含量显著高于D1、D3组，同时抑制了D3组对虾肝胰腺合成脂肪的能力，表现为D3组对虾血淋巴中MDH活性显著低于D1组。
3.4 不同脂肪酸钙替代豆油对凡纳滨对虾抗氧化功能和免疫酶活性的影响本试验中，各组间凡纳滨对虾存活率没有显著差异。在大多数的研究中，肝胰腺的功能都是检测肝胰腺中各类酶的活性[30]，可以反映肝胰腺对生长的影响及具有的生理生化作用功能。甲壳动物缺乏免疫球蛋白，主要依靠非特异性免疫来提高对疾病的抵抗力，本试验中，各组间凡纳滨对虾肝胰腺中AKP、ACP活性及T-AOC均无显著差异，D1组肝胰腺GSH-Px活性显著高于D2、D3组；各组间血淋巴中GSH-Px、ACP活性均无显著差异，D3组MDA含量显著高于D1、D2组。MDA含量是反映对虾免疫能力的重要免疫指标，在对虾防御体系中发挥重要作用[31]，MDA可以损伤生物膜结构，主要损伤的是细胞质膜，从而引起细胞膜结构和功能上的损伤，并且改变膜的通透性，影响一系列生理生化反应的正常进行。EPA+DHA可以降低致炎因子的活性，在防治炎症和自身免疫性疾病方面有一定作用，还可以改善人的先天性免疫能力，并使低密度脂蛋白的体内氧化活性增加[32]。D3组EPA+DHA含量低于D2、D1组，导致D3组的抗氧化能力较弱，从而引起MDA含量升高。
4 结论综上所述，在本试验条件下，综合考虑凡纳滨对虾生长性能、免疫性能、代谢性能等指标，饱和脂肪酸钙和不饱和脂肪酸钙均可作为新资源完全替代饲料中的豆油，且以不饱和脂肪酸钙的替代效果更优。
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