2. 内蒙古农业大学动物科学学院, 呼和浩特 010018
2. College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
饲料资源短缺是制约我国畜牧业发展的主要因素之一,其中能量饲料、蛋白质饲料和优质粗饲料普遍缺乏,饲料资源总量不足。2017年全国玉米进口量为282.54万t,苜蓿进口量达到50万t。我国是种植业大国,年产秸秆约9亿t[1],但秸秆纤维含量高,若经科学处理,可作为优质粗饲料资源的补充。利用微生物对一些废弃的农副产品资源进行生物发酵处理,改善其营养品质,越来越受到人们的重视。Shrivastava等[2]研究发现,发酵后小麦秸营养价值远远高于发酵前。利用微生物进行秸秆发酵生产各种酶类也是当前的一个研究热点,且侧重于提高菌种产酶能力、固态发酵基质配比和发酵条件的研究。紫外、化学诱变因效果好、操作简单、条件和设备要求较低,是提高微生物产酶能力的常用方法。陈仕伟[3]对野生菌黑曲霉H13进行离子束与钴60复合诱变发现,突变菌木聚糖酶活达到25 700 U/g,其对稻草秸秆断裂拉力约为试验前的3.3%。王春丽等[4]以紫外诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,获得突变菌β-葡萄糖苷酶活性较原菌提高39%。陈娜等[5]以黑曲霉TJ02为原菌,对其进行硫酸二乙酯化学诱变,筛选得到突变菌黑曲霉DES-7,其β-葡萄糖苷酶活性较原菌提高30%。因此,本文拟利用紫外、化学和复合等诱变方法,对黑曲霉X1进行诱变,筛选产纤维分解酶和秸秆降解能力强的突变菌,并对其固态发酵产酶工艺参数优化,为玉米秸秆高效生物利用提供指导。
1 材料与方法 1.1 试验菌种试验用原菌菌种为黑曲霉X1,由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。
1.2 培养基传代培养基:玉米秸秆粉5 g(沸水洗至无色,过200目筛),硫酸铵[(NH4)2SO4]1.65 g,磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5 g,七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25 g,琼脂18~20 g,自然pH,用蒸馏水定容至1 L。
筛选培养基(双层):底层为2%琼脂,上层为刚果红玉米秸秆培养基。刚果红玉米秸秆培养基:玉米秸秆粉5 g,硫酸铵1.65 g,刚果红0.3 g,磷酸氢二钾0.5 g,七水合硫酸镁0.25 g,脱氧胆酸钠0.2%,琼脂18~20 g,自然pH,用蒸馏水定容至1 L。将玉米秸秆沸水煮30 min,再用热水洗至无色,烘干后粉碎过200目,备用。
固态发酵培养基1:玉米秸秆10 g(粉碎至2 mm),2%硫酸铵,25 mL水。
固态发酵培养基2:玉米芯(60目)3 g,麸皮7 g,硫酸铵0.4 g,磷酸氢二钾0.2 g,接种量1 mL(107个/mL),料水比1.0:1.5,自然pH,30 ℃培养68 h。
1.3 孢子悬液制备将黑曲霉孢子悬液2.5 mL(107个/mL)接入50 mL的限量培养液(葡萄糖0.1%,硫酸铵0.05%),30 ℃、150 r/min培养,记录孢子萌动过程,以萌动率20%~30%为最佳萌动时间。
1.4 黑曲霉紫外、化学和复合诱变将黑曲霉种子液稀释为40个/mL孢子菌悬液,进行紫外诱变(吸取10 mL孢子悬液至直径为6 cm养皿中,365 nm紫外线波长,分别照射8、11、14、17、20、23 min,并不断搅拌)和化学诱变(取3.5 mL孢子悬液加入1 mL硫酸二乙酯和0.5 mL无水乙醇的混合液,混匀后分别诱变1、2、3、4、5、6 min,加入0.5 mL 25%硫代硫酸钠以终止反应,以加无菌水为对照)处理,吸取一定量诱变菌液均匀涂布于玉米秸秆刚果红培养基上,30 ℃恒温培养36 h。菌落计数,计算致死率。将第1轮突变菌交叉再进行紫外和化学诱变,操作步骤同上。
1.5 正突变菌筛选以玉米秸秆刚果红为培养基,挑选平板上生长快、产孢晚、透明圈大的菌落,制种,固态发酵培养基发酵培养,测定纤维素酶(NY/T 912—2004)、木聚糖酶(GB/T 23874—2009)和滤纸酶(GB/T 23881—2009)活性,并根据酶活性进一步筛选优良菌株。
1.6 突变菌产酶发酵条件优化 1.6.1 单因素试验以基础培养基为基准,30 ℃恒温培养。依次对碳源配比(玉米芯:麸皮分别为0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4),发酵时间(36、42、48、54、60、64、68、72、76、80、84 h),硫酸铵浓度(0、1%、2%、3%、4%、5%、6%),磷酸二氢钾浓度(0、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)及孢子(107个/mL)接种量(0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4 mL)等因素依次进行单因素试验,每个处理3个重复。测定不同发酵条件下所产纤维素酶、木聚糖酶和滤纸酶活性,并获得适宜发酵产酶条件。
1.6.2 正交试验根据对单因素试验的结果分析,设计并进行L9(34)的正交试验,即选择单因素试验中对产酶影响较大的4个因素,每个因素设3个水平进行正交试验,从而确定突变菌产木聚糖酶、纤维素酶和滤纸酶最优固态发酵条件组合,并进行验证。
1.7 数据统计分析运用SPSS 19.0统计软件,进行单因素方差分析,正交试验设计采用极差分析方法进行统计分析。结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 黑曲霉X1紫外、化学诱变与突变菌筛选将黑曲霉X1孢子萌发6 h(萌发率为20%)后进行诱变,最佳紫外照射时间为17 min(致死率为80%),最佳化学诱变反应时间为5 min(致死率为80%)。经多轮紫外、化学诱变处理,挑选出(玉米秸秆刚果红培养基,培养60 h)各轮诱变菌透明圈直径比值较大的初筛突变菌,经固态发酵培养基1进行复筛,黑曲霉X1突变菌产酶能力见表 1。通过突变菌菌落大小比较,获得4株黑曲霉X1突变菌,并对初筛获得突变菌进行固态发酵复筛。由表可知,突变菌黑曲霉X1U4-1较原菌黑曲霉X1木聚糖酶活性提高了8.8%(P < 0.05),纤维素酶活性提高了7.5%(P < 0.05)。因此,将黑曲霉X1U4-1作为下轮交叉复合诱变的出发菌。
突变菌X1U4-1经多轮紫外、化学诱变处理,挑选出(玉米秸秆刚果红培养基,培养60 h)各轮诱变菌透明圈直径比值较大的初筛突变菌,经固态发酵培养基2复筛,黑曲霉X1U4-1突变菌产酶能力见表 2。通过突变菌菌落大小比较,获得2株黑曲霉X1U4-1诱变后的突变菌,并对初筛获得突变菌进行固态发酵复筛。由表可知,黑曲霉X1U4-1经复筛,未获得产酶能力较高的突变菌,但黑曲霉X1U4-1滤纸酶活性较原菌黑曲霉X1提高了66.7%(P < 0.05),木聚糖酶活提高了3.8%(P>0.05)。这可能是复合诱变的协同作用不明显,所以采用单一诱变筛选出突变菌。因此,将黑曲霉X1U4-1作为固态发酵的出发菌。
由表 3可知,滤纸酶、纤维素酶、木聚糖酶活性均呈现出先上升后下降的趋势,滤纸酶活性在玉米芯:麸皮=2:8时达到最大值,与玉米芯:麸皮=1:9时差异不显著(P>0.05),显著高于其他各比例(P < 0.05)。纤维素酶活性在玉米芯:麸皮=2:8时达到最大值,与玉米芯:麸皮=3:7时差异不显著(P>0.05)。木聚糖酶活性在玉米芯:麸皮=4:6时达到最大值,与玉米芯:麸皮=3:7时差异不显著(P>0.05)。综合考虑滤纸酶、纤维素酶、木聚糖酶活性,最后确定玉米芯:麸皮=3:7为黑曲霉X1U4-1的最优碳源比例。
由表 4可知,滤纸酶活性在发酵时间为54 h时达到最大值,与发酵时间为68 h时差异不显著(P>0.05);纤维素酶活性在发酵时间为84 h时达到最大值,木聚糖酶活性在发酵时间为68 h时达到最大值。由于发酵时间越短,对于生产和节能越有利,因此,黑曲霉X1U4-1产酶的最佳发酵时间为68 h。
由表 5可知,滤纸酶活性在硫酸铵浓度为1%时达到最大值,与硫酸铵浓度为4%时差异不显著(P>0.05)。纤维素酶活性在硫酸铵浓度为4%时达到最大值。木聚糖酶活性在硫酸铵浓度为6%时达到最大值,与硫酸铵浓度为4%时差异不显著(P>0.05)。因此,黑曲霉X1U4产酶的最佳硫酸铵浓度为4%。
由表 6可知,磷酸二氢钾浓度对滤纸酶、木聚糖酶活性无显著影响(P>0.05),磷酸氢二钾浓度为2.0%时滤纸酶、木聚糖酶性活最高。磷酸氢二钾浓度为3.5%时纤维素酶性活最高,与磷酸氢二钾浓度为2.0%时差异不显著(P>0.05)。因此,黑曲霉X1U4-1产酶的最佳磷酸二氢钾浓度为2.0%。
由表 7可知,接种量对滤纸酶和纤维素酶活性无显著影响(P>0.05),接种量为1.2 mL时滤纸酶活性最高。接种量为1.3 mL时木聚糖酶活性最高,与接种量为1.2 mL时差异不显著(P>0.05)。因此,黑曲霉X1U4产酶的最适接种量为1.2 mL(107个/mL)。
根据单因素试验结果,选择对黑曲霉X1U4固态发酵产酶影响较大的4个因素(发酵时间、硫酸铵浓度、接种量、玉米芯:麸皮)进行L9(34)的正交试验,由表 8可知,影响滤纸酶活性的主要因素依次是硫酸铵浓度>玉米芯:麸皮>发酵时间>接种量,其最优发酵条件为硫酸铵浓度5%、玉米芯:麸皮=2:8、发酵时间68 h、接种量1.0 mL。影响纤维素酶活性的主要因素依次是发酵时间>玉米芯:麸皮>接种量>硫酸铵浓度,其最优发酵条件为发酵时间72 h、玉米芯:麸皮=3:7、接种量1.2 mL、硫酸铵浓度4%。影响木聚糖酶活性的主要因素依次是玉米芯:麸皮>硫酸铵浓度>接种量>发酵时间,其最优发酵条件为玉米芯:麸皮=4:6、硫酸铵浓度4%、接种量1.0 mL、发酵时间68 h。
在上述正交试验优化条件下,对原菌黑曲霉X1和诱变菌黑曲霉X1U4-1固态发酵产纤维素酶、木聚糖酶和滤纸酶活性的最适发酵条件进行验证。由表 9可知,黑曲霉X1U4-1滤纸酶和纤维素酶的最优发酵条件为发酵时间72 h、玉米芯:麸皮=3:7、接种量1.2 mL、硫酸铵浓度4%,活性分别可以达到0.77和93.80 U/g。木聚糖酶最优发酵条件为玉米芯:麸皮=4:6、硫酸铵浓度4%、接种量1.0 mL、发酵时间68 h,活性可以达到9 336.71 U/g。
将黑曲霉X1和黑曲霉X1U4-1发酵产物菌液稀释成相同木聚糖酶活性,通过发酵玉米秸秆不同反应时间(6、12 h)后测定其降解秸秆产生还原糖含量;利用原发酵产物测定其中的外切葡聚糖酶、β-木聚苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。由表 10可知,黑曲霉X1U4-1的还原糖含量和β-葡萄糖苷酶活性均高于黑曲霉X1,还原糖含量(12 h)时提高了6.8%,β-葡萄糖苷酶活性提高了22.3%。这就可以解释突变菌黑曲霉X1U4-1在刚果红玉米秸秆筛选培养基上的透明圈较原菌大而且透明的原因。
秸秆产量丰富,蕴含大量能值,但不易被动物消化利用,若经科学处理,可作为非常规饲料添加到畜禽饲粮中,利用微生物产生的多种纤维分解酶将秸秆转化为易于动物消化吸收形式的饲料资源是当前秸秆综合利用的研究热点[6]。通过诱变和基因改造获得高产酶能力的优良菌株是生物酶解处理秸秆的关键。由于霉菌的成熟分生孢子处于休眠状态,若采取合适的方法使菌株的孢子萌发,则能够改善诱变育种的效果[7]。刘春芬[8]试验表明,利用萌发的孢子进行诱变可以有效提高菌株正突变率。因此本试验对黑曲霉X1孢子进行萌发处理,对黑曲霉X1萌动孢子进行紫外、硫酸二乙酯、紫外-硫酸二乙酯复合诱变,筛选获得产酶能力较强的突变菌黑曲霉X1U4-1,其与原菌相比,发酵秸秆产还原糖量(12 h)含量提高了6.8%,β-葡萄糖苷酶活性提高了22.3%,滤纸酶活性提高了66.7%,木聚糖酶活性提高了3.8%。这说明黑曲霉X1U4-1对秸秆降解能力较原菌强,诱变有效。
在菌株筛选过程中如何快速获得优良的突变菌十分关键,本研究通过诱变菌透明圈大小和固态发酵酶活性测定进行初筛与复筛。前人对高产纤维菌株的筛选用羧甲基纤维素作为筛选培养基的碳源[9-10],而本试验以玉米秸秆作为筛选培养基的碳源,主要优点为玉米秸秆是天然纤维,可较准确地表示菌株对玉米秸秆降解情况,且通过黑曲霉降解秸秆产还原糖含量和其他酶活性测定,验证了透明圈筛选的准确性。可作为一种快速筛选高效降解作物秸秆丝状菌株的方法。
碳源是微生物生命活动主要能量来源,同时黑曲霉是诱导菌,不同类型的碳源对其产酶能力具有显著影响。麸皮作为碳水化合物,不仅能为霉菌提供微量元素,还含有粗纤维、粗蛋白质等,对霉菌具有一定的诱导作用[11]。本试验结果表明,发酵培养基添加麸皮可有效提高黑曲霉产酶能力。
氮是微生物细胞重要营养素,也是菌体合成酶蛋白质的关键营养成分。微生物不仅可利用有机氮,还可大量利用非蛋白氮。因有机氮源价格昂贵,硫酸铵等无机氮常作为微生物发酵的主要氮源[12]。黄丹梅等[13]在研究黑曲霉产脂肪酶时最适硫酸铵浓度为2%,与本试验结果不一致。
磷酸盐可为微生物生长所必不可少的磷元素。另外有研究表明,纤维素酶在水解的过程伴随着产酸。培养基中添加高浓度碳源时,菌体代谢碳源会产生大量的酸,导致发酵pH下降,从而影响菌体生长和产酶能力。在固态发酵培养基中加入一定量的磷酸盐不仅能起缓冲作用,还可促进微生物的生长。
固态发酵的过程中不能进行养分补充,接种量对发酵产酶能力影响至关重要,接种量大小直接影响发酵周期。大量接入成熟的菌种,可以缩短微生物生长过程的延滞期,但在发酵生产上,接种量过大有时会影响正常发酵,如单位耗氧量增加,导致体系缺氧。张谦等[14]和吴升山等[15]分别研究发现,黑曲霉最佳接种量为1.9%和7.0%。与本试验结果不一致。
4 结论① 对黑曲霉X1进行多轮紫外、化学和交叉复合诱变,获得1株产纤维分解酶能力较强的突变菌黑曲霉X1U4-1,与原菌相比,滤纸酶活性提高了66.7%,木聚糖酶活性提高3.8%,β-葡萄糖苷酶活性提高了22.3%,还原糖含量(12 h)提高了6.7%。
② 黑曲霉X1U4-1最优固态发酵条件为:玉米芯:麸皮=3:7、发酵时间72 h、接种量1.2 mL(107个/mL)、硫酸铵浓度4%、磷酸二氢钾浓度2%,在此条件下,滤纸酶活性达到0.77 U/g,纤维素酶活性达到93.80 U/g,木聚糖酶活性达到9 383.18 U/g。
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