早期断奶仔猪极易遭受应激而发生“仔猪早期断奶综合征”,造成肠道损伤继而引发消化功能紊乱及腹泻[1]。大量研究表明,早期断奶可使仔猪肠道功能受损,主要表现为肠黏膜组织结构破坏、通透性增加、肠上皮细胞紧密连接受损以及炎性因子大量表达等,给养猪生产带来诸多不利影响[2-4]。因此,如何减少断奶应激所导致的肠道损伤,研究和开发无污染、无公害、无残留的新型绿色饲料添加剂己成为当今动物营养领域研究的热点之一。前期研究发现,姜黄素可通过改善断奶仔猪肠黏膜形态结构,降低肠黏膜通透性,提高肠黏膜紧密连接和免疫功能,起到保护肠黏膜屏障的作用[5-6]。然而,关于其分子机制还不清楚。
研究发现,肠道损伤所涉及的缺血、炎症、凋亡等多个病理机制与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号道路的调节有关。MAPK信号通路参与了细胞存活、增殖、分化、凋亡、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理或病理过程[7]。目前,在哺乳动物肠道组织细胞内已经发现至少存在4种MAPK,分别为p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和细胞外信号调节激酶5/大丝裂原活化蛋白激酶1(ERK5/BMK1)。栾兆双等[8]研究发现断奶应激激活了MAPK信号通路,且抑制p38 MAPK和JNK通路后,肠黏膜屏障得到改善,而抑制ERK1/2通路后肠黏膜屏障损伤有加重的趋势。宋卫兵[9]研究发现姜黄素对氨甲蝶呤(MTX)致大鼠小肠炎模型的肠黏膜上皮p38信号转导通路有抑制作用,可以抑制p38磷酸化,不影响对ERK、JNK蛋白的表达,从而发挥对肠黏膜屏障的保护作用。那么,姜黄素发挥对断奶仔猪肠黏膜屏障的保护作用,MAPK是如何参与此过程,还有待深入研究。本试验通过建立大肠杆菌断奶应激模型,研究姜黄素和MAPK信号通路对断奶仔猪空肠黏膜形态、通透性以及紧密连接蛋白和炎性因子mRNA相对表达量的影响,为探索姜黄素保护断奶仔猪肠黏膜屏障功能的分子机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物与设计选取胎次、体重相近的21日龄“杜×长×大”健康早期断奶仔猪30头,随机分成5组,每组6头仔猪。于试验开始第1天分别腹腔注射2 mg/kg的姜黄素(B组)、p38 MAPK抑制剂(C组)、JNK抑制剂(D组)和ERK1/2抑制剂(E组),之后隔日同一时间同一剂量注射,空白对照组(A组)注射等量的生理盐水,试验期为5 d。各组于试验开始第2天经口服感染大肠杆菌,按每头猪总大肠杆菌1×109 CFU分早、晚2次给服,仔猪自由采食和饮水,按常规程序进行管理。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
饲养试验结束后,所有仔猪早晨空腹前腔静脉取血,3 000 r/min离心10 min,取血清分装于1.5 mL离心管,-20 ℃保存,用于测定血清内毒素和D-乳酸含量。在空肠中部取约5 cm的肠段,生理盐水清洗内容物后放入4%多聚甲醛固定液固定肠管。另取10 cm左右空肠肠段用剪刀剖开,清除内容物,滤纸吸干,用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的载玻片轻轻刮取肠黏膜,分装在2 mL离心管中,立即放入液氮速冻,-80 ℃保存。
1.3 空肠形态学分析经4%多聚甲醛固定肠管,再经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、连续切片后,进行苏木精-伊红(HE)染色,中性树胶封片。每张切片选取5个视野拍照,每张照片中选取2根最长、绒毛完整且走向平整的空肠绒毛,测定绒毛高度及隐窝深度,并计算绒毛高度/隐窝深度。
1.4 血清内毒素和D-乳酸含量测定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测血清内毒素和D-乳酸含量,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.5 空肠黏膜紧密连接蛋白和炎性因子mRNA相对表达量的测定引物设计:从NCBI下载已登录的猪甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、咬合蛋白(occludin)、闭合小环蛋白-1(ZO-1)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10 mRNA的基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计引物,引物序列见表 2。
RNA提取:采用RNAiso Plus试剂盒提取空肠黏膜组织RNA,用核酸蛋白测定仪测定其吸光度(OD)值,样品OD260/280在1.8~2.2可用于后续试验,cDNA合成按TaKaRa反转录试剂盒说明操作,反转录后的cDNA于-80 ℃保存备用。
荧光定量PCR:每个样品做3个重复,反应体系(10 μL):SYBR ® Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus, 2×) 5 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 2 μL,forward primers 1 μL,reverse primers 1 μL。反应程序:95 ℃ 7 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。
1.6 数据分析试验数据用Excel 2010初步整理后,采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较,以P < 0.05作为差异显著性标准,结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 空肠黏膜形态由表 3可知,E组空肠黏膜形态指标与对照组差异均不显著(P>0.05)。与A和E组相比,B、C组空肠绒毛高度显著提高(P < 0.05),隐窝深度显著降低(P < 0.05),绒毛高度/隐窝深度显著提高(P < 0.05),且B组绒毛高度/隐窝深度显著高于C组(P < 0.05);D组绒毛高度/隐窝深度显著高于A和E组(P < 0.05),而D组绒毛高度和隐窝深度与A、E组相比差异不显著(P>0.05)。
由表 4可知,与A、E组相比,B、C、D组血清内毒素、D-乳酸含量显著降低(P < 0.05),B、C组血清内毒素含量显著低于D组(P < 0.05);E组血清D-乳酸含量显著高于对照组(P < 0.05),血清内毒素含量与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
由图 1可知,E组ZO-1和occludin mRNA相对表达量与对照组相比差异不显著(P>0.05)。与A、E组相比,B、C、D组仔猪空肠黏膜ZO-1和occludin mRNA相对表达量显著提高(P < 0.05),B组ZO-1 mRNA相对表达量显著高于D组(P < 0.05)。
由图 2可知,E组空肠黏膜炎性因子mRNA相对表达量与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。与A、E组相比,B、C、D组IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),IL-10 mRNA相对表达量显著提高(P < 0.05)。
3 讨论仔猪遭受断奶应激可导致肠道绒毛萎缩和隐窝增生、肠黏膜屏障受损,进而导致腹泻[10]。前期研究发现,饲粮中添加姜黄素可显著提高空肠和回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度,说明姜黄素可改善小肠黏膜上皮形态,从而提高对营养物质的消化吸收能力,达到对机体促生长作用[5-6]。研究表明,肠道损伤所涉及的缺血、炎症、凋亡等多个病理机制与MAPK信号道路调节有关。栾兆双等[8]研究发现,断奶应激激活了p38 MAPK信号通路,仔猪断奶前腹腔注射p38 MAPK和JNK抑制剂,仔猪小肠形态较对照组得到明显的改善,且p38 MAPK抑制剂效果较明显,可能与p38 MAPK通过间接激活低分子质量热休克蛋白27,进而介导细胞骨架重构以及促进肠损伤后上皮细胞存活、增殖和修复过程有关[11]。本试验结果表明,与对照组相比,姜黄素、p38 MAPK抑制剂显著提高了空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度,JNK抑制剂也显著提高了绒毛高度/隐窝深度,而ERK1/2抑制剂组与对照组差异不显著,可见姜黄素、p38 MAPK和JNK抑制剂对断奶仔猪小肠形态有相似的改善作用。
相关研究表明,早期断奶后仔猪肠道通透性增加,诱导肠道产生炎症反应,紧密连接蛋白的表达和分布发生变化,进一步使肠道的通透性增强,肠上皮屏障功能降低,最终导致腹泻[12-13]。血清D-乳酸和内毒素含量是监测肠黏膜通透性变化的重要指标。当肠黏膜受损时,血清D-乳酸和内毒素含量升高[14-15]。紧密连接蛋白是肠道通透的结构基础,其中ZO-1和occludin是观察紧密连接屏障功能和通透性功能的重要指标[15-16]。我们前期研究发现,姜黄素可减轻大肠杆菌对肠黏膜屏障的损伤,提高紧密连接蛋白ZO-1和occludin mRNA表达,降低肠黏膜的通透性[5]。本试验结果表明,断奶仔猪腹腔注射姜黄素、p38 MAPK抑制剂、JNK抑制剂显著提高空肠黏膜ZO-1和occludin mRNA相对表达量,降低血清内毒素和D-乳酸含量,与肠黏膜形态学结果相一致,这与栾兆双等[8]仔猪断奶前注射p38 MAPK和JNK抑制剂使仔猪肠道通透性显著降低的研究结果相似。
仔猪在断奶时由于遭受断奶应激导致肠道微生态破坏,病原菌在肠道内大量增殖,引起肠道局部炎症反应,产生大量促炎性因子,导致肠道紧密连接遭到破坏,引起肠黏膜屏障功能损伤[17-18]。Pié等[13]也报道,断奶引起仔猪肠黏膜短暂的促炎因子表达增加。TNF-α通过降低肠上皮电阻和增加细胞旁路通透性诱导肠上皮屏障功能损伤[19]。我们前期研究结果发现,姜黄素显著降低大肠杆菌攻毒仔猪肠黏膜促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量,提高抗炎因子IL-10 mRNA相对表达量[5-6]。本试验结果显示,与对照组相比,腹腔注射姜黄素、p38 MAPK抑制剂、JNK抑制剂显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量,显著提高IL-10 mRNA相对表达量,提示姜黄素与p38 MAPK和JNK抑制剂可能通过抑制炎症细胞因子的表达,提高肠黏膜紧密连接,从而保护肠黏膜屏障功能。宋卫兵[9]研究发现,姜黄素对大鼠小肠炎模型肠黏膜的保护作用的机制可能是通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号通路,进而抑制TNF-α、IL-1β mRNA表达,促进IL-10 mRNA表达增加来实现的,对ERK和JNK信号通路没有影响。Li等[20]研究发现,姜黄素可能是通过抑制p38 MAPK信号通路,减少TNF-α等促炎因子的释放,从而减轻溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜炎症损伤。杨雪静等[21]也研究发现,姜黄素可通过抑制p38激酶磷酸化缓解内毒素诱导肠黏膜损伤。而栾兆双等[8]研究发现,抑制p38 MAPK和JNK信号通路,可能通过抑制炎症细胞因子的表达,减轻仔猪肠道炎症,从而保护肠黏膜屏障。但姜黄素通过MAPK信号通路调控仔猪肠黏膜屏障功能的分子机制还有待进一步研究。
4 结论本试验条件下,姜黄素、p38 MAPK抑制剂和JNK抑制剂通过改善大肠杆菌攻毒仔猪小肠黏膜形态,降低肠黏膜通透性,提高紧密连接蛋白mRNA表达和降低炎性因子mRNA表达,从而改善肠黏膜屏障功能,而ERK1/2抑制剂对肠黏膜屏障损伤无改善作用。
[1] |
TAN B, LI X G, KONG X F, et al. Dietary L-arginine supplementation enhances the immune status in early-weaned piglets[J]. Amino Acids, 2009, 37(2): 323-331. DOI:10.1007/s00726-008-0155-1 |
[2] |
YIN F G, LIU Y L, YIN Y L, et al. Dietary supplementation with Astragalus polysaccharide enhances ileal digestibilities and serum concentrations of amino acids in early weaned piglets[J]. Amino Acids, 2009, 37(2): 263-270. DOI:10.1007/s00726-008-0142-6 |
[3] |
SMITH F, CLARK J E, OVERMAN B L, et al. Early weaning stress impairs development of mucosal barrier function in the porcine intestine[J]. American Journal of Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology, 2010, 298(2): 352-363. |
[4] |
HU C H, XIAO K, LUAN Z S, et al. Early weaning increases intestinal permeability, alters expression of cytokine and tight junction proteins, and activates mitogen-activated protein kinases in pigs[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(3): 1094-1101. DOI:10.2527/jas.2012-5796 |
[5] |
XUN W J, SHI L G, ZHOU H L, et al. Effects of curcumin on growth performance, jejunal mucosal membrane integrity, morphology and immune status in weaned piglets challenged with enterotoxigenic Escherichia coli[J]. International Immunopharmacology, 2015, 27(1): 46-52. |
[6] |
荀文娟, 周汉林, 侯冠彧, 等. 姜黄素对早期断奶仔猪回肠黏膜形态、紧密连接蛋白和炎性因子基因表达以及血清免疫球蛋白水平的影响[J]. 动物营养学报, 2016, 28(3): 826-833. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2016.03.023 |
[7] |
COSTANTINI T W, PETERSON C Y, KROLL L, et al. Role of p38 MAPK in burn-induced intestinal barrier breakdown[J]. Journal of Surgical Research, 2009, 156(1): 64-69. DOI:10.1016/j.jss.2009.03.066 |
[8] |
栾兆双, 宋娟, 胡彩虹. 丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂对断奶仔猪小肠形态和肠通透性的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(1): 44-49. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2013.01.007 |
[9] |
宋卫兵.姜黄素对肠黏膜屏障保护作用的实验研究[D].博士学位论文.广州: 南方医科大学, 2008: 35-42. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-90023-2009023885.htm
|
[10] |
CERA K R, MAHAN D C, CROSS R F, et al. Effect of age, weaning and postweaning diet on small intestinal growth and jejunal morphology in young swine[J]. Journal of Animal Science, 1988, 66(2): 574-584. DOI:10.2527/jas1988.662574x |
[11] |
郑曙云, 付小兵, 徐建国. MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复[J]. 中国危重病急救医学, 2004, 16(1): 59-62. DOI:10.3760/j.issn:1003-0603.2004.01.023 |
[12] |
DRUCKER D J. Gut adaptation and the glucagon-like peptides[J]. Gut, 2002, 50(3): 428-435. DOI:10.1136/gut.50.3.428 |
[13] |
PIÉ S, LALLÉS J P, BLAZY F, et al. Weaning is associated with an upregulation of expression of inflammatory cytokines in the intestine of piglets[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(3): 641-647. DOI:10.1093/jn/134.3.641 |
[14] |
BRANDT R B, SIEGEL S A, WATERS M G, et al. Spectrophotometric assay for D-(-)-lactate in plasma[J]. Analytical Biochemistry, 1980, 102(1): 39-46. |
[15] |
胡彩虹, 钱仲仓, 刘海萍, 等. 高锌对早期断奶仔猪肠黏膜屏障和肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2009, 40(11): 1638-1644. DOI:10.3321/j.issn:0366-6964.2009.11.010 |
[16] |
BERKES J, VISWANATHAN V K, SAVKOVIC S D, et al. Intestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier, ion transport, and inflammation[J]. Gut, 2003, 52(3): 439-451. DOI:10.1136/gut.52.3.439 |
[17] |
AL-SADI R M, BOIVIN M, MA T Y. Mechanism of cytokine modulation of epithelial tight junction barrier[J]. Frontiers in Bioscience, 2009, 14: 2765-2778. |
[18] |
BARREAU F, HUGOT J P. Intestinal barrier dysfunction triggered by invasive bacteria[J]. Current Opinion in Microbiology, 2014, 17: 91-98. DOI:10.1016/j.mib.2013.12.003 |
[19] |
XIAO K, CAO S T, JIAO L F, et al. TGF-β1 protects intestinal integrity and influences Smads and MAPK signal pathways in IPEC-J2 after TNF-α challenge[J]. Innate Immunity, 2017, 23(3): 276-284. DOI:10.1177/1753425917690815 |
[20] |
LI C P, LI J H, HE S Y, et al. Effect of curcumin on p38 MAPK expression in DSS-induced murine ulcerative colitis[J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(2): 3450-3458. DOI:10.4238/2015.April.15.8 |
[21] |
杨雪静, 侯佳惠, 彭来君. 姜黄素调控COX-2表达对内毒素诱导的肠黏膜信号通路转录影响的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26(3): 326-328. |