益生菌是指一类可调节动物肠道内微生物的分布与平衡的微生物及其相关物质，具有降低有害菌在肠道的定植，增加机体免疫功能的作用^[1]。益生菌最初作为饲料添加剂的应用是基于替代饲料中抗生素的目的。1969年，Swann^[2]建议在动物饲料中限制使用抗生素；2006年，欧盟全面禁止在饲料中使用预防性抗生素，益生菌作为饲料添加剂在动物饲料中的应用更加广泛。目前，我国批准用于饲料添加剂的益生菌有34种，其中16种是乳酸菌。近年来研究发现，乳酸菌除具有常规的替代抗生素的作用外，还具有吸附重金属的作用。利用乳酸菌吸附重金属的特性，在水体和土壤的重金属污染治理上已有较多的研究和应用^[3-4]，然而利用乳酸菌的这一功能开展对饲料中重金属污染吸附的研究尽管目前仍处于起步阶段，但具有广阔的发展前景。

1 畜禽饲料及粪便中的重金属污染状况

近年来随饲料加工业的快速发展，饲料中重金属污染问题日渐引起人们的重视。重金属是指一类密度大于4.5 kg/dm³的金属或类金属物质，包括铅、镉、汞、铬、砷等。重金属可通过生物链的转化，最终进入生物体并在其体内蓄积，且不易降解，对生物体造成显著的危害作用^[5]。研究数据表明，亚洲地区30%的全价饲料、预混料、无机矿物质和有机矿物质等样本中含有重金属，且含量超过了欧盟可接受标准^[6]。一些家禽饲料样本中重金属的含量极高，如来自东南亚的家禽饲料样本中铅含量高达722 mg/kg，氧化锌中铅含量为3 023 mg/kg，硫酸铜中镉含量为2 019 mg/kg。姚亚军等^[7]对全国22个饲料生产的主要省份的饲料企业中所使用的矿物质原料(磷酸氢钙、石粉、膨润土和沸石粉)和微量元素添加剂(氧化锌、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸铜和硫酸锰)的重金属元素进行检测，结果发现常量矿物质饲料添加剂中重金属元素超标严重。石粉中重金属元素铅、砷和镉含量超标达30%，硫酸铜中砷含量超标达12.54%，硫酸锌和氧化锌中镉含量超过5 mg/kg的样品率分别达53.3%和33.3%，硫酸锰中镉含量超标达41.67%。柏雪等^[8]调查四川地区常用的68种能量饲料原料和48种蛋白质饲料原料的重金属铜、铅、砷、镉、铬等含量，发现铬和铅含量在样品中的超标率较高，其中米糠中铅含量超标率达100%，菜籽粕中铬、铅含量超标率均在70%以上，提示部分饲料原料中的重金属污染严重，应引起重视并采取相应措施来控制。

饲料中重金属的超标随即带来其在畜禽产品中的残留和粪便中含量过高的污染风险。畜禽粪便中的重金属除铅、镉、砷、汞外，还含有铜、锌。铜、锌属于微量营养元素，在畜禽饲料中适量添加能促进动物的生长，铜可提高饲料脂肪消化率，锌还可减少仔猪腹泻。但目前饲料中铜、锌的添加量较高，超量添加的铜、锌除少量在机体内转化利用和沉积外，大部分随粪便排出体外，这也是畜禽粪便中铜、锌含量过高的原因。朱恩等^[9]调查发现，上海地区规模化养殖场的畜禽粪便重金属超标率大小依次是锌、铜、砷、汞和镍，超标率达63.1%。王湧等^[10]报道指出，我国部分猪、禽粪便是重金属污染的重灾区，其中最容易超标的重金属是铜、锌，且猪粪便的重金属污染程度高于禽类粪便。石奥等^[11]调查北京市36家畜禽养殖场，发现畜禽粪便中猪粪的重金属污染问题最严重，铜、锌含量超标率超过70%，鸡粪次之，锌含量超标率达46%。畜禽粪便作为有机肥的循环使用，将重金属向土壤和环境中转移，通过生物链的转化，再次回到饲料中，加重重金属的富集。

2 乳酸菌的特点及分离鉴定

乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，属于兼性厌氧菌，细胞形态为杆状(双歧杆菌、乳杆菌等)或球状(链球菌、片球菌、明串珠菌等)，且不产生内生孢子，也无运动性，过氧化氢酶试验为阴性。乳酸菌是动物肠道内的优势菌群，刚出壳的雏鸡粪链球菌和肠杆菌首先定植在盲肠，而空肠和直肠菌群以乳酸杆菌、双歧杆菌等为主^[12]。猪的整个肠道都分布着乳酸菌，包括双歧杆菌等黏附在肠上皮细胞或黏液层。从畜禽肠道分离和鉴定乳酸菌主要依据上述乳酸菌的特点进行，包括细胞形态学检查和生化试验。近年来利用16S rRNA基因序列分析技术实现了对乳酸菌进行快速准确的种属鉴定，具体方法是提取乳酸菌DNA，采用16S rRNA基因扩增通用引物，经PCR扩增后，测定其16S rRNA基因序列，测序结果与NCBI数据库中的序列作对比，根据序列相似性，利用MEGA软件，对未知菌株序列构建进化树。向双云等^[13]采用此种方法对12株从健康成年鸡肠道中分离得到的未知菌进行鉴定，确定5株为乳酸杆菌、3株为唾液乳杆菌、2株为肠球菌、1株为罗伊氏乳杆菌和1株为葡萄球菌。此种方法与常规方法相比具有鉴定效率高、操作简便、耗时少等优点，适用于乳酸菌的快速鉴定。

3 乳酸菌对重金属的吸附作用及其影响因素

乳酸菌对重金属的吸附作用与乳酸菌的结构特征关系密切。乳酸菌作为革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，除含有肽聚糖、中性多糖外，还含有磷壁酸、表面蛋白等，一方面这些物质形成的网状结构利于吸附重金属，另一方面细胞壁上的蛋白质带有大量的负电荷基团如O—H、C—O、C=O、N—H、C—H、C—N，这些基团与金属阳离子发生络合反应结合在一起。翟齐啸^[14]通过组分分离逐层剥离法分析发现，绝大部分的镉被吸附在细胞壁和细胞膜表面，仅约10%的镉离子(Cd²⁺)进入原生质体内部。进一步利用基团掩蔽法证明菌体表面氨基及羧基在吸附镉过程中起到重要作用，而磷酸基团和镉吸附的关联性不强。倪奕弘^[15]利用傅里叶红外光谱(FT-IR)技术发现甲基和羧基是铜离子(Cu²⁺)结合中最主要的活性基团；Åvall-Jääskeläinen等^[16]研究发现，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)细胞表面的S-Layer蛋白具有结合Cd²⁺的能力。

不同种类的细菌对重金属的吸附存在差异，这种差异可能是由菌株自身的特殊性质如细胞结构、功能基团、表面积及细菌种属等决定的。李兰松^[17]利用同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)发现，抗性细菌BL9在受到重金属离子镍离子(Ni²⁺)、锌离子(Zn²⁺)和Cu²⁺胁迫16~20 h后其蛋白质表达谱变化较大，具有氧化还原酶、金属离子结合等活性的蛋白质的表达出现显著差异。由此表明，细菌不仅利用细胞外聚合物和细胞壁上的官能团对重金属产生抗性和吸附作用，还能通过促进外流、减少摄取的方式，降低菌体细胞质金属离子浓度，减少过量金属离子的毒害作用。

乳酸菌对重金属的吸附能力与乳酸菌的种类、数量和金属溶液离子浓度等相关。翟齐啸^[14]筛选得到的5株耐镉乳酸菌对50 mg/L镉溶液中镉的吸附率从10.7%到31.4%不等，显示出菌株间的差异性。而在pH、初始镉溶液浓度和吸附时间都相同的条件下，同样含量的1 g/L的鼠李糖乳杆菌(LGG)冻干菌株镉吸附率达22.1%^[3]，而LGG湿菌株镉吸附率仅为10.7%^[14]，相差1倍多，其原因在于冻干菌株的数量比湿菌株的数量多。翟齐啸^[14]研究发现，乳酸菌对不同初始浓度的镉溶液的吸附率不同，在5 mg/L低浓度的镉溶液中，镉的吸附率可达60%，而随镉浓度升高至100 mg/L，镉的吸附率低于25%。倪奕弘^[15]利用扫描电镜(SEM)研究发现，发酵乳杆菌受到Cu²⁺浓度影响，其细胞成分和外表微观结构发生改变；当Cu²⁺浓度为40 mg/L时，细胞表现出较好的耐受性；而随着Cu²⁺浓度的升高，细胞结构受到损害，当Cu²⁺浓度达到100 mg/L时，细胞结构严重破坏，细胞出现断裂和穿孔，表面及周围黏附了大量的沉淀物质。除乳酸菌外，其他的一些细菌也表现出对重金属吸附能力受到金属离子浓度影响的特性。瞿佳等^[18]从土壤中筛选到1株Zn²⁺最大耐受浓度20 mmol/L的不解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum asaccharolyticum)，对Zn²⁺的吸附率随Zn²⁺浓度的升高而降低，当Zn²⁺浓度从2 mmol/L上升到10 mmol/L时，对Zn²⁺的吸附率从55.25%下降到33.11%。

4 抗重金属乳酸菌的筛选鉴定 4.1 抗重金属铅的乳酸菌筛选鉴定

铅是银白色金属，在地球上的分布广泛，加之铅的毒性较大，筛选抗铅的乳酸菌研究相对较多。Halttunen等^[19]对一批经典菌株包括LGG、双歧杆菌、干酪乳杆菌等进行了铅吸附试验，显示LGG对铅吸附性能良好，干酪乳杆菌对铅也具有一定的吸附能力。Bhakta等^[20]从来自受重金属污染的淤泥样品分离出大量具有铅抗性的乳酸菌，其中有7株可高效去除铅，最高的1株铅去除率达59%。满兆红等^[21]从肉鸡肠道内容物及排泄物中筛选出1株抗铅性和吸附性较好的屎肠球菌，其对铅的抗性为800 mg/L，铅的去除率为66.95%。夏爽等^[22]从猪、马、牛、鸡、犬、鱼等多种畜禽和生物的肠道内容物及排泄物中分离筛选出具有耐受重金属铅特性的4株乳酸菌：罗伊氏乳杆菌、粪肠球菌、嗜淀粉乳杆菌、乳酸乳球菌，对铅的吸附率可达到84.23%。贾原博等^[23]从重金属污染严重的矿区土壤中分离筛选出13株耐铅能力较强的乳酸菌，包括2株戊糖片球菌、1株清酒乳杆菌、5株食窦魏斯氏菌、2株戊糖乳杆菌、3株植物乳杆菌，耐受性最高的菌株可在8.4 g/L的铅浓度下仍可生长。沈薇等^[24]从30份健康、足月新生儿粪便中分离得到3株可耐受500 mg/L铅离子浓度的干酪乳杆菌，吸附试验表明对低浓度(1 mg/L)铅离子的吸附率高达90.40%，对高浓度(50 mg/L)铅离子的吸附率可达86.27%。

4.2 抗重金属镉的乳酸菌筛选鉴定

镉为银白色，有金属光泽，原子序数为48。镉的毒性极强，位列第6位有毒有害物质。Bhakta等^[20]从重金属污染的淤泥样品中分离出5株抗镉乳酸菌，最高的1株对镉的去除率达25%。熊婧^[25]从土壤和人粪便样品中分离出11株对重金属镉有较高耐受能力[最小抑菌浓度(MIC)≥4.0 g/L]的菌株，其中7株为乳酸菌；同时对17株标准乳酸菌通过MIC测定，筛选出4株对镉具有高耐受性的乳酸菌(MIC≥4.0 g/L)。这些乳酸菌对100 mg/L Cd²⁺水溶液的吸附率达到21.0%~31.4%。翟齐啸^[14]筛选出植物乳杆菌CCFM8610具有较强的镉耐受能力，可耐受1 000 mg/L的镉。

4.3 抗重金属汞的乳酸菌筛选鉴定

汞是常温下唯一的液态金属，易蒸发，汞及其汞化合物在自然界广泛存在，汞的生物富集效应较强。陈金泰等^[26]从健康狐狸和貉子粪便中筛选出1株耐受500 mg/L氯化汞的乳酸片球菌，并克隆出汞抗性基因即汞还原酶(mercury redutase, MerA)基因。

4.4 抗重金属铜和锌的乳酸菌筛选鉴定

铜和锌常理上是归属于维持动物正常生长及生理生化功能的必需的微量矿物元素，但因为在饲料中常存在超量添加的现象，因而在筛选具有抗重金属的乳酸菌时除了铅、镉、砷、汞、铬5种重金属，还包括铜、锌。刘文等^[27]从饲喂高铜高锌饲粮的仔猪粪便中分离出89株耐锌和65株耐铜的疑似乳酸杆菌，最终筛选确定8株高耐受铜、锌的菌株，可耐受25 mmol/L的铜和150 mmol/L的锌。通过16S rRNA基因序列同源性分析主要为嗜酸乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。

5 抗重金属乳酸菌对动物机体的影响 5.1 抗重金属乳酸菌对动物机体内重金属的去除

体外试验表明，具有重金属抗性的乳酸菌，对离子态的重金属具有吸附去除作用，而相关的动物试验证实乳酸菌可以减少重金属在试验动物体内的吸收和沉积。Bhakta等^[28]获得的1株益生菌E. faecium Pb12，具有较高的重金属去除效率，经重金属抗性和移除及抗生素抗性标准评判，认为其可作为饲料中潜在的益生菌去除肠道尤其是鱼类肠道中的重金属，控制重金属的生物累积。Zhai等^[29-30]将抗镉乳酸菌CCFM8610饲喂小鼠，结果表明CCFM8610可显著降低小鼠急性中毒和慢性中毒后的肠道吸收，减少镉在组织器官的沉积，减轻组织器官的氧化应激，逆转肝脏和肾脏的损害，改善相应的组织变化。都启晶等^[31]将嗜铅肠球菌JT₁饲喂大鼠4周后，与空白对照组相比，显著降低大鼠血铅含量。而嗜铅肠球菌JT₁对经自由饮水方式亚慢性铅中毒的小鼠，可清除血液中79.4%的铅，具有明显的除铅作用^[32]。Giri等^[33]在鲤鱼饲料中添加加罗伊氏乳杆菌P16，减少了鲤鱼在铅暴露环境中的死亡率和体内组织中铅的沉积，提高了鲤鱼的生长性能，并减轻了铅暴露带来的氧化应激，修复了肠道酶的活性。

5.2 抗重金属乳酸菌对动物机体铜、铁、锰、锌、钙元素的影响

微量元素铜、铁、锰、锌和常量元素钙是动物机体必需的营养元素，同属二价金属离子，在机体内与二价金属结合蛋白——金属硫蛋白(MT)结合转运至组织内。重金属铅、镉等可与铁、铜等竞争金属硫蛋白，影响铜、铁、锰、锌、钙在机体内的吸收代谢。肝脏和肾脏是动物机体的重要脏器，也是重金属铅、镉等作用的主要靶器官。多数研究表明，重金属砷、镉、铅等影响铁、铜、锰、锌、钙等在肝脏和肾脏的沉积，但影响的结果并不一致^[34-35]。而Zhai等^[30]研究表明，在无镉暴露条件下饲喂抗镉乳酸菌CCFM8610的小鼠与未饲喂小鼠相比，其肝脏、肾脏的钙、锌、镁的含量无显著差异，肾脏铁含量后者高于前者；在镉暴露条件下，补加抗镉乳酸菌CCFM8610组的小鼠肝脏钙、铁的含量显著高于未补加组。这一研究结果说明抗镉乳酸菌CCFM8610对钙、锌、铁、镁在小鼠组织内的吸收沉积并无不良影响。

6 小结和展望

工业化的进程不可避免带来重金属在环境中的累积，重金属的生物迁移性使之在不断循环转化。针对目前畜禽饲料中存在重金属污染的现状，寻找和开发新的去除重金属污染的材料和方法，从而降低重金属污染对畜禽生产的影响，是未来畜禽安全养殖的要求和方向。微生物尤其是乳酸菌具有良好的重金属吸附性能，对于减轻和去除环境中的重金属已有较多的实践和应用。鉴于此，将其开发应用于饲料重金属的吸附，不失为经济适用的方法。一些研究结果预示了其可作为减轻和去除重金属在动物体内蓄积的饲料补充物，但目前抗重金属乳酸菌的研究多集中在抗性菌株的筛选上，在具体动物试验应用上研究较少，真正意义上的抗重金属的乳酸菌还未见有规模化的生产和应用。要想实现这一目标需要完善相关的动物试验数据，包括乳酸菌株的选择和试验动物的确定等。尽管任重而道远，但具有重金属抗性的乳酸菌应用前景依然广泛。