, JIN Lu*, SUN Haizhou
, SANG Dan, LI Shengli, ZHANG Chunhua, ZHANG Chongzhi, REN Xiaoping, SHAN Dan, LING Shuli
饲粮碳水化合物和粗蛋白质的合理配比以及在瘤胃中粗蛋白质和碳水化合物的同步发酵对反刍动物氮代谢有一定的影响。碳水化合物占反刍动物饲粮干物质的60%~80%，分为结构性碳水化合物和非结构性碳水化合物。碳水化合物在瘤胃中发酵产生有机酸(乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和戊酸)、气体(甲烷、二氧化碳)和能量能够促进合成微生物蛋白[1]。瘤胃内有机酸的含量和贮存的时间直接影响瘤胃内环境，影响瘤胃pH的稳态。瘤胃微生物发酵产生的挥发性脂肪酸(VFA)70%被瘤胃-网胃吸收，剩余的VFA在瓣胃中吸收。由于VFA种类不同且分子大小也不同，其被吸收的速度也不同，当瘤胃液pH＞7时，吸收速度依次为乙酸＞丙酸＞丁酸；当瘤胃液pH＜7时，吸收速度快慢则相反[2]。关于瘤胃VFA的吸收机制，以前的研究认为，VFA在瘤胃中的吸收是被动扩散，短链脂肪酸(SCFA)在瘤胃中以解离(SCFA-)或非解离(HSCFA)的形式存在。SCFA-能够与H+结合，产生亲脂性的分子HSCFA，只有非解离形式的SCFA能够以被动扩散的形式通过脂质膜[3]。但是，瘤胃中非解离的SCFA只是全部SCFA的小部分。目前，从质子化SCFA的低浓度和非质子化SCFA的低渗透性可推测出，SCFA的吸收还存在着其他的吸收机制。随着研究的深入发现，瘤胃上皮还存在着另外2种SCFA吸收途径：依赖碳酸氢盐的途径和不依赖碳酸氢盐的途径(硝酸盐敏感性转运途径)[4]。SCFA-能够通过瘤胃上皮的SCFA-/HCO3-交换蛋白来转运，蛋白介导的转运途径还与Na+、K+及H+离子转运过程有关[5]。硝酸根离子(NO3-)与瘤胃上皮中阴离子交换机制相互作用，通过VFA-/HCO3-和Cl-/HCO3-交换剂在瘤胃上皮顶膜运输VFA-(或Cl-)[6]。现有的一些零星数据显示，对于乙酸来讲，HCO3-依赖性转运、硝酸盐敏感性转运和被动扩散所占比例分别为0~14%、42%~57%和29%~59%；对于丁酸，3种途径所占比例分别为24%~46%、0~4%和25%~76%[7]。在目前的养殖生产中，养殖者在饲养成本高、家畜生长性能低和饲料资源浪费严重的多重压力下，往往通过追求高精料的投入来提高家畜的生长性能，这样的饲养模式通常会导致反刍家畜机体内能氮不平衡、氮的利用率低、瘤胃发酵失衡等一系列问题的出现。如何通过可发酵碳水化合物的调控技术，来提高动物机体氮利用率，已成为当前反刍动物营养研究的热点。本文通过给绵羊饲喂不同非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(NFC/NDF)饲粮，探究其对细毛羊氮代谢、瘤胃内环境及VFA吸收的影响。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理选用9只体况良好、体重为(44.20±4.35) kg的装有永久性瘤胃瘘管的鄂尔多斯细毛羊半同胞羯羊，按体重随机分3组，每组3只，单笼饲养，于每日08:00和17:00先粗后精等量饲喂2次，自由饮水。准确记录每日试验羊只的采食量和剩料量，试验预试期为15 d，正试期为7 d。
1.2 试验饲粮基础饲粮配制参照NRC(2007)饲养标准，1组、2组和3组饲粮的NFC/NDF分别为0.35、0.66和1.14，粗蛋白质含量均为13.60%，试验饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
正式试验前1天，给试验羊带上集粪袋和集尿袋，试验第3~7天采集粪和尿。准确记录每天总排尿量和粪量。粪样取10%进行风干、粉碎，待测。尿样用10%的硫酸调整pH低于3.0，并取总量的10%于-20 ℃保存待测。粪样和尿样中粗蛋白质和NDF含量参照张丽英[8]所编《饲料分析与饲料质量检测技术》中方法进行测定，尿中尿素氮含量参照樊艳华[9]的方法进行测定。
试验第2、3、4天，早晨空腹由颈静脉采血10 mL装入含有肝素钠的采血管中，4 ℃、3 000×g条件下离心15 min，制备血浆，置于-20 ℃保存。血浆中尿素氮含量参照樊艳华[9]的方法进行测定。
1.3.2 瘤胃发酵特性的测定试验第7天采食前、采食后1.5、3.0及4.5 h时采集瘤胃液。将收集到的瘤胃液直接用便携式pH计测定pH。然后4层纱布过滤，将过滤后的溶液以3 500 r/min离心10 min，取上清液5 mL置于采样小瓶中，用于测定瘤胃液中氨态氮(NH3-N)含量；再另取上清液4 mL装入预先装有1 mL 25%的偏磷酸-甲酸(体积比: 3 : 1)混合溶液的采样小瓶中，用以测定瘤胃液中VFA含量。其中，NH3-N含量参照冯宗慈等[10]的比色方法测定；VFA含量参照樊艳华[9]的内标法测定。
1.3.3 瘤胃上皮VFA吸收相关基因表达量的测定根据GenBank中公布的基因序列，利用Primer 5.0软件设计各个特异性引物，以甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，测定下调式腺瘤载体(DRA), 假定阴离子转运蛋白1(PAT1), 阴离子交换蛋白2(AE2), 单羧酸转运蛋白1、4(MCT1、MCT4), Na+/H+交换蛋白1、3(NHE1、NHE3), vH+ATP酶泵(vH+ ATPase)和钠/钾ATP酶泵(Na+/K+ ATPase)基因表达量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息见表 2。
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表 2 引物信息 Table 2 Information of primers |
通过瘤胃瘘管采集试验羊的瘤胃壁乳头，首先经瘘管掏出部分瘤胃食糜，暴露腹囊部乳头，清水冲洗掉食糜，用剪刀剪取少量的瘤胃壁乳头，用预冷的磷酸缓冲溶液(PBS，pH=7.4)反复冲洗后，装入无酶无菌的冻存管中，放入液氮中保存待测。采用Trizol法提取总RNA。参照PrimeScript RT Master Mix反转录试剂盒说明书的操作步骤将样品总RNA都以相同浓度进行反转录，然后以cDNA为模板，GADPH为内参基因，在ABIMP3005荧光定量PCR仪上进行相对定量。相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。
1.4 数据分析数据处理采用SAS 9.0软件的ANOVA进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较。试验结果均以平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著判断标准，以P＜0.01作为差异极显著判断标准。
2 结果 2.1 饲粮不同NDF/NFC对细毛羊氮代谢的影响由表 3可知，饲粮NFC/NDF对绵羊干物质采食量及摄入氮无显著影响(P＞0.05)。各组间粪氮、尿氮和沉积氮无显著差异(P＞0.05)。1组尿中尿素氮含量显著高于2组(P＜0.05)，极显著高于3组(P＜0.01)，并且2组显著高于3组(P＜0.05)。粪中NDF含量受饲粮NFC/NDF的影响，随饲粮NFC/NDF的增加而减少，1组和2组显著高于3组(P＜0.05)。
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表 3 饲粮不同NFC/NDF对细毛羊氮代谢的影响 Table 3 Effects of dietary different NFC/NDF on nitrogen metabolism of fine wool sheep |
由表 4可知，采食前各组间NH3-N含量无显著差异(P﹥0.05)。采食1.5和3.0 h以后，1组NH3-N含量显著高于3组(P＜0.05)。随采食时间的增加，NH3-N含量也随之增加，但在采食4.5 h后，各组间NH3-N含量无显著差异(P＞0.05)。pH均在6.0~6.8，且随饲粮NDF/NFC的增加而降低，1组pH显著高于3组(P＜0.05)。
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表 4 饲粮不同NFC/NDF对细毛羊瘤胃液NH3-N含量和pH的影响 Table 4 Effects of dietary different NFC/NDF on NH3-N content and pH in rumen liquid of fine wool sheep |
由表 5可知，乙酸含量随饲粮NFC/NDF的增加而减小，采食1.5 h后，1组乙酸含量显著高于2组(P＜0.05)，极显著高于3组(P＜0.01)。丙酸含量随饲粮NFC/NDF的增加而增加，采食1.5、3.5和4.0 h后，2组丙酸含量显著低于3组(P＜0.05)。1组采食前及采食后丁酸含量均显著高于3组(P＜0.05)。1组采食前戊酸和异戊酸含量显著高于2组和3组(P＜0.05)。
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表 5 饲粮不同NFC/NDF对细毛羊瘤胃液VFA含量的影响 Table 5 Effects of dietary different NFC/NDF on VFA content in rumen liquid of fine wool sheep |
由表 6可知，饲粮NDF/NFC对MCT1、PAT1、vH+ ATPase和AE2基因表达量没有显著影响(P＞0.05)。NHE3和DRA基因表达量随饲粮NDF/ NFC的增加而增加，2组和3组显著高于1组(P＜0.05)。MCT4基因表达量反而随饲粮NDF/NFC的增加而降低，1组显著高于2组和3组(P＜0.05)。而2组NHE1和Na+/K+ ATPase基因表达量显著高于1组和3组(P＜0.05)，而2组和3组之间无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 饲粮不同NDF/NFC对细毛羊瘤胃上皮VFA吸收相关基因表达量的影响 Table 6 Effects of dietary different NDF/NFC on VFA absorption related gene expression in rumen epithelium of fine wool sheep |
本试验研究结果表明，饲粮不同NFC/NDF对总排泄氮和沉积氮无显著影响，说明沉积氮和总排出氮不受饲粮碳水化合物结构的影响。本试验为了提高饲粮对氮代谢影响评价的准确性，特意测定了血浆中和尿中尿素氮含量。一般来讲，动物摄入的氮越多，尿中尿素氮含量也越多。反刍动物瘤胃中可发酵碳水化合物和蛋白质同步发酵有利于微生物蛋白的合成，降低氮的浪费，提高氮的利用率。本试验中，1组饲粮的NFC较低，使瘤胃中可发酵碳水化合物较低，而蛋白质过量，过剩的蛋白质则以尿素的形式排出体外，从而使尿中尿素氮含量随着饲粮NFC/NDF的增加而减少。此外，饲粮中NDF水平的高低会直接影响粪中NDF的含量。本试验结果得出，粪中NDF含量随饲粮NFC/NDF的增加而减少。饲粮中NDF主要被瘤胃微生物所降解，而瘤胃微生物对NDF的降解有局限性，饲粮过高的NDF使其在瘤胃中的降解不充分，从而排出体外。
3.2 饲粮不同NDF/NFC对细毛羊瘤胃内环境的影响瘤胃pH是瘤胃内环境的综合指标，也是反映瘤胃健康状态的第1指标。瘤胃pH受饲粮结构和饲粮营养的影响。研究发现，瘤胃pH变化范围为5.0~7.5，变动的规律取决于饲粮性质和饲喂后的时间，一般在饲喂后2~6 h达最低值[11]。本试验中，饲粮瘤胃可降解蛋白相同时瘤胃pH在6.0~6.8，随饲粮NFC/NDF的增加而降低。陈宁[12]研究发现，断奶犊牛瘤胃pH随饲粮精粗比提高而显著下降。王海荣等[13]通过饲喂不同NDF水平的饲粮，发现瘤胃pH只随饲粮NDF水平的增加显著提高。本试验结果与之相同，可能是饲粮可发酵碳水化合物的增加，瘤胃中产生大量的有机酸，使瘤胃pH降低。瘤胃pH是相对稳定的值，会受采食时间的影响，采食之后pH会降低，随着时间的延长而再上升。
瘤胃pH的波动与瘤胃NH3-N和VFA含量相关。NH3-N是瘤胃内饲粮含氮物质发酵终产物，VFA是碳水化合物发酵终产物。瘤胃VFA是弱酸性，VFA的大量积累会使瘤胃pH降低。为避免过多的瘤胃VFA的沉积，瘤胃会排出VFA，即吸收和流通到后消化道中。NH3-N和VFA含量与饲粮结构有关。研究报道，瘤胃总SCFA含量的增加和pH的降低与饲粮精粗比或NFC的水平有关[14]。本试验结果表明，饲粮瘤胃可降解蛋白相同时，瘤胃VFA含量随饲粮NFC/NDF的增加而增加。其中乙酸含量随饲粮NFC/NDF的增加而减少，而丙酸含量随之增加。瘤胃SCFA的变化，不仅受饲粮成分的影响，也与采食后时间相关。最高的SCFA含量在饲粮饲喂2~4 h之后[15]。增加饲喂频率可使瘤胃内环境更加稳定[16]。Gäbel等[17]研究表明，每天在24 h之内定时定量饲喂奶牛牧草和高谷物精料，结果SCFA含量和pH较稳定。然而，Hall[18]研究认为，瘤胃VFA含量并不适宜作为评价瘤胃发酵进程或微生物产物形成的指标，这主要是由于瘤胃液相容积变化太大造成的，并建议评价时还需对瘤胃容积和VFA摩尔百分比进行测定。因此，在今后的研究中还需更进一步的摸索。
3.3 饲粮不同NDF/NFC对细毛羊瘤胃上皮VFA吸收的影响SCFA的50%~85%在瘤胃-网胃中吸收[19]。目前，从质子化SCFA的低含量和非质子化SCFA的低渗透性可推测出，SCFA的吸收还存在着其他的吸收机制。SCFA-能够通过瘤胃上皮的SCFA-/HCO3-交换蛋白来转运。SCFA-/HCO3-的交换者包括PAT1、DRA和AE2[20]。细胞内的HCO3-是通过AE2转运到细胞内或通过碳水化合物的水和作用，即CO2和H2O通过碳酸脱氢酶的反应合成H2CO3(CO2+H2O→H2CO3)，H2CO3分解产生H+和HCO3-。最近，研究者发现了不依赖碳酸氢盐的SCFA-转运通道[3-4]。这个通道对硝酸盐有敏感性，但是对不依赖碳酸氢盐的吸收机制还不太清楚。当然，细胞中SCFA-或其代谢产物也可以通过MCT1从基底外侧膜进入到血液，随后在肝脏或外周组织中进行代谢。因此，从上述研究来看，瘤胃上皮存在着3种SCFA吸收途径：被动扩散、依赖碳酸氢盐的途径和不依赖碳酸氢盐的途径。考虑到85%的SCFA被瘤胃上皮吸收，那么瘤胃上皮中还会存在其他必不可少的吸收途径。
SCFA在依赖碳酸氢盐的吸收途径中，瘤胃上皮Na+的转运和SCFA的转运紧密相关。从瘤胃上皮顶膜进入细胞内的HSCFA进行解离，需要低的蛋白激酶(APka)活性和细胞内较高的pH[17]。释放的H+，增加细胞内的酸度，刺激Na+的转运通道NHE1和NHE3。NHE1和NHE3位于顶膜和基底外侧膜，共同调节Na+的转运和细胞质pH水平[21]。从顶膜进入细胞的Na+通过基底外侧膜的Na+/K+-ATPase从细胞中排出。Na+/K+-ATPase因电化学梯度而发生，依靠能量引导Na+的输出、Na+的转运通道NHE1和NHE3的启动[22]。从以上的VFA吸收机制可知，SCFA通过依赖碳酸氢盐的吸收途径，可以向瘤胃内提供碳酸氢盐，它能够抑制二氧化碳和水产生碳酸氢盐的反应，从而降低H+的含量。在基底外侧也存在碳酸氢盐的转运，进行阴离子的交换，将SCFA从细胞中输出进入动脉中。因此，这个转运机制在调节瘤胃pH时有着重要的作用。
Doreau等[23]和Sakata等[24]的研究证明，给牛和羊饲喂高水平的可发酵饲粮，不仅可以提高瘤胃发酵，还可以提高瘤胃SCFA的吸收。Sehested等[25]通过尤斯灌注方法测得，奶牛饲喂适当的高精料饲粮，尽管不增加瘤胃上皮乳头面积，但也会增加丙酸的吸收。Kuzinski等[26]报道，山羊饲喂高精料饲粮能够增加瘤胃上皮MCT1基因表达量。此外，在奶牛饲喂高精料饲粮时，增加了瘤胃上皮DRA基因表达量[27]。这些结果表明，饲粮能够通过调控SCFA转运载体进而影响瘤胃SCFA的吸收能力。Yan等[2]研究结果表明，山羊高精料组SCFA转运载体(MCT1、MCT4、DRA、PAT1、AE2)和Na+/K+ ATPase基因表达量高于低精料组。由此可以推测出，山羊瘤胃上皮吸收SCFA的能力随着饲粮饲喂高精料而提高，基因NHE1、NHE2、NHE3、vH+ ATPase和Na+/K+ATPase等的表达可维持pH的稳定，高精料组的调节程度高于低精料组。Yang等[28]的研究证明，高精料饲粮使瘤胃上皮NHE1和NHE3基因表达量增加。因此，SCFA吸收增加及细胞内调节pH相关基因表达量的增加对于机体具有重要的生理意义，SCFA的增加使细胞内质子增加，导致质子必须从细胞中排出，进而维持pH[4]。本试验研究结果表明饲粮瘤胃可降解蛋白相同，NDF/NFC不同时，NHE3和DRA基因表达量随饲粮NFC的增加而增加，MCT4基因表达量反而随饲粮NFC的增加而降低。此结果与闫磊等[29]通过饲粮精粗比探究奶牛VFA吸收相关基因表达的结果相似。
4 结论在本试验条件下，饲粮NFC/NDF的水平对瘤胃内环境有显著的影响，瘤胃液总VFA、丙酸和丁酸含量随饲粮NFC/NDF的增加而增加，其中乙酸含量随饲粮NFC/NDF增加而降低；随着饲粮NFC含量的增加，与瘤胃VFA吸收相关的基因NHE3和DRA表达量显著增加，而MCT4基因表达量反而降低。
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