仔猪早期断奶因肠道发育不完善、自身免疫功能较弱，易引起断奶应激综合征，严重影响仔猪生长发育[1]。氧化应激是影响断奶仔猪生长性能和免疫功能的一个重要因素。在生产过程中，氧化应激会降低仔猪机体免疫力和生长性能，引起仔猪多种疾病和发育不良，给生猪养殖企业带来较大经济损失[2]。在生产实践中，广泛应用抗生素和高锌来缓解断奶仔猪的应激反应[3]。但是，研究人员发现使用抗生素容易产生药物残留、细菌耐药性等弊端；动物饲用高剂量的锌后由于锌的消化率低，会随着粪便大量排出体外，造成资源浪费和环境污染[4]。欧盟、荷兰和美国等多个国家已经限定仔猪饲粮中锌的添加量。因此，探索锌的合理利用方法，积极寻找有效缓解仔猪断奶应激的抗生素替代品成为热门。
在已知方法中，使用纳米氧化锌是替代传统氧化锌的潜在可行方案，与传统氧化锌比，纳米氧化锌对仔猪抗断奶应激效果更加显著[5]。纳米氧化锌与其他普通的氧化锌相比具有吸收快、生物利用率高、抗氧化性强等特点，这些特点使其替代传统的锌添加剂具有可行性。毛俊舟等[6]的研究表明，在断奶仔猪饲粮中添加凹土纳米氧化锌可提高仔猪生长性能，降低腹泻率，改善仔猪生长发育，同时可降低血液甘油三酯和总胆固醇含量，提高血液高密度脂蛋白含量，加强脂代谢和胰腺发育，可替代抗生素和高锌的使用。方洛云等[7]的研究表明，饲粮中添加纳米氧化锌可以使肝脏中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性提高28.2%。但也有研究表明，动物饲粮中添加过量纳米氧化锌具有不同程度的不利作用[8]。
凹凸棒土，简称凹土(attapulgite，ATP)，又名坡缕石(palygorskite)，是一种层链状过渡结构的含水镁铝硅酸盐矿物，以凹凸棒石矿物为特征组分，理论化学式为Si8Mg5O20(OH)2(OH)4·4H2O，无毒、无味、无刺激性，廉价易得。凹土具有表面多孔、比表面积大、阳离子可交换特性，且对铅离子(Pb2+)、铜离子(Cu2+)、抗生素等具有良好的吸附效果[9-12]。凹土的表面积大小决定了它的吸附能力，它的棒晶状结构在经过活化处理后，其表面积进一步扩大，并且凹土内部存在强大的库仑场和极性，因此具有极强的物理吸附性。因此，凹土2011年被列入饲料添加剂名单[13]。Masimango等[14]和朱振海等[15]研究发现，饲喂断奶仔猪2 000 mg/kg凹土降低了小肠中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等含量，减少了机体内氧自由基等含量。但是，也有研究者认为动物机体对营养物质的吸收随着凹土添加量的增加有所降低[16-17]。目前，已有的研究仅限于在饲粮中添加高剂量的凹土，饲粮中添加500~1 000 mg/kg纳米氧化锌对仔猪方面的影响也结论不一。因此，本试验在前人研究的基础上，结合实际生产考虑，改变单一物质的添加方式，利用凹凸棒土负载纳米氧化锌颗粒组成凹土纳米氧化锌，通过在断奶仔猪饲粮中添加不同剂量凹土纳米氧化锌，探讨凹土纳米氧化锌对断奶仔猪抗氧化功能的影响，确定凹土纳米氧化锌适宜的添加量和其替代抗生素和高锌作为新型绿色添加剂的可能性。
1 材料与方法 1.1 试验材料及动物试验所用氧化锌(白色粉末状)、纳米氧化锌(白色粉末状，纯度≥99%，平均粒径45 nm)、凹土纳米氧化锌(由20%凹凸棒土负载80%纳米氧化锌组成，理化特性同纳米氧化锌；凹凸棒土主要成分为硅酸盐，双层链状结构，纯度为85%)由扬州大学化工学院提供；50%喹乙醇、15%金霉素、10%硫酸黏菌素由扬州大学饲料厂提供(本试验所用硫酸黏菌素和喹乙醇时间符合中华人民共和国农业部公告中使用标准，且以上材料仅限于试验研究使用，旨在替代抗生素的使用)。
试验仔猪为21日龄杜×长×大断奶仔猪，由苏州市太仓金诸农业发展有限公司提供。
1.2 试验设计试验选取21日龄体重(6.30±0.51) kg的健康杜×长×大断奶仔猪210头，随机分为7组，每组6个重复，每个重复5头猪。各组分别为对照组(CON组，基础饲粮)、抗生素组(ANT组，基础饲粮+100 mg/kg 50%喹乙醇+150 mg/kg 15%金霉素+ 50 mg/kg 10%硫酸黏菌素)、氧化锌组(ZO组，基础饲粮+ 3 000 mg/kg氧化锌)、纳米氧化锌组(NZO组，基础饲粮+ 800 mg/kg纳米氧化锌)和低、中、高剂量凹土纳米氧化锌组(LANZ、MANZ和HANZ组，分别饲喂基础饲粮+700、1 000和1 300 mg/kg凹土纳米氧化锌)。试验于2017年4月在江苏省太仓金诸种猪场进行，预试期3 d，正试期9 d。
1.3 饲养管理及基础饲粮猪场属于规模化生产，设备齐全，防疫及管理措施完善。试验仔猪均在同一舍内饲养，饲粮为粉料，仔猪自由采食(每日饲喂4次，饲喂时间分别为06:30、10:30、14:30、18:30，每次添加量以料槽中略有剩余为宜)，自由饮水。每天清扫栏舍，保持栏内卫生，自然通风，日常管理、消毒与防疫按照猪场常规程序进行。
基础饲粮参照NRC(2012)仔猪营养需要标准并结合生产实践配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验结束后采样，采样前12 h停止饲喂，每个重复随机抓取2头仔猪。颈静脉采血后装入10 mL离心管中，静置10 min后3 000 r/min离心30 min，取上清液待测。采集血液后使用二氧化碳(CO2)窒死，打开腹腔，采集肝脏组织装于2 mL冻存管中；分离小肠各段，用载玻片刮取空肠、回肠段黏膜，装入冻存管。样品放于液氮保存，后转移至-80 ℃待测。
1.5 测定指标及方法测定血清、肝脏、空肠段黏、回肠段黏膜抗氧化指标，测定指标分别为过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、SOD活性和MDA含量以及总抗氧化能力(total antioxygentic capacity，T-AOC)。具体操作方法见试剂盒说明书，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.6 统计分析采用Excel 2007软件对数据进行初步处理，用SPSS 19.0进行统计，采用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响由表 2可知，ZO和LANZ组血清CAT活性显著高于CON组(P < 0.05)；ANT、ZO、LANZ、MANZ和HANZ组血清T-AOC显著高于CON组(P < 0.05)，且ANT组血清T-AOC显著高于其他各组(P < 0.05)。各组间血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响 Table 2 Effects of attapulgite nano zinc oxide on serum antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 3可知，LANZ组肝脏CAT活性显著高于其他各组(P < 0.05)。各组间肝脏SOD、GSH-Px活性和MDA含量及T-AOC无显著差异(P>0.05)。
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表 3 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of attapulgite nano zinc oxide on liver antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 4可知，ZO、NZO、LANZ、MANZ和HANZ组空肠黏膜SOD活性显著高于ANT组(P＜0.05)。ZO、LANZ组空肠黏膜CAT活性显著高于CON和ANT组(P＜0.05)。ANT、ZO、NZO、LANZ和HANZ组空肠黏膜T-AOC显著高于CON和MANZ组(P＜0.05)。各组间空肠黏膜GSH-Px活性和MDA含量无显著差异(P>0.05)。
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表 4 凹土纳米氧化锌断奶仔猪空肠黏膜抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of attapulgite nano zinc oxide on jejunum mucosa antioxidant indexes of weaned piglets |
由表 5可知，HANZ组回肠黏膜CAT活性显著低于CON组(P＜0.05)，ZO和NZO组回肠黏膜GSH-Px活性显著低于CON、ANT和LANZ组(P＜0.05)。各组间回肠黏膜SOD活性、MDA含量和T-AOC无显著差异(P>0.05)。
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表 5 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪回肠黏膜抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of attapulgite nano zinc oxide on ileum mucosa antioxidant indexes of weaned piglets |
正常生理状态下，动物体内会持续产生自由基和抗自由基活性物质，它们之间的平衡影响着细胞代谢的安全，而氧化应激会诱导自由基过量产生，打破机体的氧化还原平衡状态，从而产生过多的活性氧等会破坏机体内的大分子物质，如蛋白质等[18-21]。T-AOC是用来评定机体抗氧化系统能力的指标，它可以反映出机体抗氧化酶系统和非酶系统对外界刺激的代偿能力及机体自由基的代谢状态[22]。CAT是动物体内的抗氧化酶，能够清除活性氧自由基和过氧化氢等，它的活性反映出机体清除自由基的能力[23]。研究表明，纳米氧化锌能够提高断奶仔猪的血清抗氧化指标。冯梦[24]研究发现，在小鼠饲粮中添加0.8 μg/mL的纳米氧化锌能够提高血清中CAT活性。本试验结果表明，饲粮添加800 mg/kg纳米氧化锌能够提高断奶仔猪血清CAT活性，并且饲粮添加凹土纳米氧化锌对CAT活性的提高效果更好。同样的。李治学[25]研究表明，饲喂断奶仔猪300 mg/kg的纳米氧化锌能够提高断奶仔猪血清中CAT活性和T-AOC，这与本试验结果相似。本试验中，饲粮添加凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血清的抗氧化指标有明显的提高作用，且效果要优于单独添加纳米氧化锌。已有研究表明，凹土棒土对机体内毒害物质和各种离子具有吸附作用[9-10]。因此我们推测添加凹土纳米氧化锌对血清抗氧化指标的提高作用主要是通过减少机体的外源性刺激，保证机体内环境的稳态，减少因外界刺激造成的自由基产量过剩，同时锌也是各种抗氧化酶的重要结构组成成分。因此，凹土和纳米氧化锌的结合能够有效地保证机体抗氧化酶的分泌，提高血清的抗氧化指标。
3.2 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响肝脏在整个机体的抗氧化防御系统中有着重要作用，它是GSH-Px和SOD活性最高的器官，也是容易产生自由基和过氧化物的组织。有研究表明，肝脏组织细胞的损伤程度与自由基毒性反应的强弱有着紧密联系[26]。方洛云等[7]研究发现，饲粮添加300 mg/kg的纳米氧化锌能够有效提高断奶仔猪肝脏CAT活性，降低肝脏过氧化氢含量，通过改变肝脏中酶的释放，缓解仔猪因断奶应激造成的机体过氧化表现。本试验结果显示，饲粮中添加700 mg/kg的凹土纳米氧化锌提高了肝脏CAT活性，但是随着凹土纳米氧化锌添加量的增加，肝脏CAT活性逐渐降低，这可能跟纳米氧化锌添加量的增加有关。但本试验未发现肝脏MDA含量有显著变化，这可能是各种添加物质对MDA均有着较好的抑制或吸附作用，控制了肝脏MDA含量。Swain等[8]研究表明，随着纳米氧化锌添加量的增加，动物机体的应激反应逐渐提高，这与本试验结果相验证。
3.3 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肠道黏膜抗氧化指标的影响GSH-Px是一种广泛存在于机体内催化过氧化物分解的酶，它能够特异性催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化物的还原反应[27]。SOD是动物体内的抗氧化酶，能够与氧自由基反应生成无害的水，它的活性反映出机体清除自由基的能力[19]。据研究，断奶仔猪肠道抗氧化指标受多种因素影响，如肠道菌群的损害、炎症和微量元素含量等[28-29]。Hu等[30]研究发现，断奶仔猪饲粮中添加600 mg/kg纳米氧化锌和沸石的混合物能有效提高肠道中SOD、CAT和GSH-Px的活性，沸石和凹土具有相似的结构和功能，均属于黏土类矿物，其能够通过降低小肠的病变，保护小肠微环境，从而维持肠道内抗氧化物质的正常分泌。本试验结果与Hu等[30]的研究结果具有相似性，饲粮添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌和抗生素等均能够有效改变肠道中抗氧化酶的活性。但整体而言，饲粮添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌对肠道的抗氧化酶促分泌作用优于抗生素、3 000 mg/kg氧化锌和其他添加量的纳米氧化锌。凹土具有控释性，能够合理控制肠道中锌的含量，改变肠道环境，同时吸附肠道内的有害物质和过氧化物，保护肠道发育，良好的肠道环境是减少动物机体氧化应激的重要因素，同时保证了肠道中抗氧化酶的分泌。
综合本试验结果，凹土纳米氧化锌对断奶仔猪抗氧化功能具有促进作用，同时结合本实验室前期研究可知，饲粮中添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌能够提高仔猪生长性能，降低腹泻率等[6]。因此，我们推测凹土纳米氧化锌能够通过缓解仔猪断奶前期的氧化应激，维护机体内环境稳态，提高了仔猪抗应激能力，从而改善机体生长性能。动物机体内环境复杂多变，凹土纳米氧化锌提高仔猪抗氧化应激能力是促进仔猪生长发育的重要因素之一，其对仔猪的具体作用效果需要进一步讨论和探究。
4 结论① 断奶仔猪饲粮中添加凹土纳米氧化锌能够提高血清、肝脏和肠道黏膜CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC，通过改变机体抗氧化酶的活性提高了仔猪的抗氧化性能，从而减少仔猪因断奶引起的氧化应激。
② 本试验中，饲粮添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌对断奶仔猪抗氧化功能的提高效果最佳，在抗氧化功能的提高效果上能够替代抗生素和3 000 mg/kg的纳米氧化锌。
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