白藜芦醇是天然存在的一种多酚类化合物，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等70余种植物或其果实中，是植物的一种次生性代谢产物，在植物抵抗病菌感染时起着重要的作用^[1]。白藜芦醇作为一种天然植物抗毒素，有多种生物活性，如抗氧化、防辐射、增强免疫力、降糖脂等多种作用^[2-5]。研究表明，白藜芦醇在蛔虫、昆虫等无脊椎动物和鸡、鼠等脊椎动物中均能发挥其生物学的作用，并且不同水平白藜芦醇对结果产生不同的影响^[6-7]。目前，关于白藜芦醇在水产上的研究还较少。闫亚楠等^[8]研究发现，在高脂饲料中添加适宜水平的白藜芦醇能提高团头鲂非特异性免疫力和抗病力，其中以1.08%的添加水平最优。但赵志祥等^[9]在饲料中添加0.1%的白藜芦醇却降低了吉富罗非鱼非特异性免疫酶活性，并且损伤肠道和肝脏。造成研究结果差异的原因还不清楚，有必要进一步研究白藜芦醇在水产上的应用效果及其作用机理。

松浦镜鲤是中国水产科学研究院黑龙江水产研究所开发的鲤科鱼类的一个新品种，因其具有较高较厚的背部、生长快、适应能力强和养殖经济效益高等诸多优点，在全国各地淡水中均可养殖，深受人们的喜爱。目前，关于白藜芦醇在松浦镜鲤上的应用还未见报道。因此，本研究通过在松浦镜鲤饲料中添加不同水平的白藜芦醇，研究对其生长性能、肠道消化酶活性、肝脏抗氧化指标和血清生化指标的影响，为其在水产上的应用提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用白藜芦醇购自景竹生物公司，纯度≥98.5%；晶体DL-蛋氨酸，纯度≥99%；晶体L-苏氨酸，纯度≥98.5%。

1.2 试验饲料

饲料中植物蛋白质源和动物蛋白质源分别来自豆粕和鱼粉，糖源来自次粉，脂肪源来自鱼油和豆油，羧甲基纤维素作为黏合剂。根据鲤鱼的营养需要配制基础饲料，基础饲料组成及营养水平见表 1。各组分别添加0(对照)、80、160、240、320和400 mg/kg的白藜芦醇，白藜芦醇用葡萄糖预混后再加入饲料中。将饲料粉碎后，根据不同的饲料配方混匀，加水，用小型的饲料颗粒机加工成2 mm颗粒料，在通风条件下自然晾干并保存于-20 ℃箱中。

1.3 试验用鱼及养殖管理

试验用鱼为状态良好的松浦镜鲤幼鱼，购自黑龙江水产研究所呼兰试验站。消毒后饲养于循环水养殖系统中，200 L水/缸。试验鱼驯养2周后，挑取健壮、规格一致的幼鱼用于试验，共选取初始体重为(3.00±0.15) g的松浦镜鲤720尾，饲养于24个水族箱中，随机分成6组，每组4个重复，每个重复30尾。每天07:00、12:00、17:00各定时投喂1次，饱食为准，同时记录投喂量。及时清除残饵和粪便，保持养殖环境的良好。试验期56 d。

1.4 样品采集

试验结束，停食24 h。清点每缸鱼的数量并称重。每缸随机取4尾鱼放在-20 ℃冰箱保存，用于分析体成分；另每缸随机取4尾鱼用浓度为100 mg/L的鱼安乐(MS-222)麻醉，放在冰袋上用无菌注射器采血。采集的样品放在离心管，放置4 ℃冰箱中1~2 h，3 500 r/min离心10 min，吸取上层血清并分装离心管中，放置于-20 ℃冰箱，用来测定血清生化指标。采集血清后，将鱼放在冰袋上解剖，取鱼肝脏和肠道，将肝脏和肠道的附属物剔除，用去离子水清洗干净。用滤纸吸干表面的水分，称重并加入9倍的0.86%的生理盐水在匀浆器中匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取上清液放置-80 ℃冰箱保存备测。

生长性能指标计算公式如下：

1.5 血清生化指标的测定

血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性的测定采用速率法，血清碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。

1.6 肠道消化酶活性的测定

蛋白酶活性采用福林-酚(Folin-phenol)法测定。福林-酚试剂在碱性条件下易被还原为蓝色化合物，本试验通过0.5%的酪素与酶液反应，生成含酚基的氨基酸与福林-酚试剂呈蓝色反应，来判断酶活性的大小，在波长680 nm下进行比色，检测吸光度。蛋白酶活性单位定义为在37 ℃下每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活性单位。脂肪酶活性测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒，具体方法参见试剂盒说明书。脂肪酶活性单位定义为在37 ℃条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个酶活性单位。淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法测定，底物为0.04%可溶性淀粉，与酶液进行反应后加入碘液，与剩余的淀粉结合成蓝色复合物，可判断出水解的淀粉量，从而计算出淀粉酶活性。淀粉酶活性单位定义为37 ℃下、30 min内，100 mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg称为1个淀粉酶活性单位。

1.7 抗氧化酶活性的测定

将保存的肝脏样品在4 ℃下解冻，在冰水浴中剪碎，然后按1 : 9的质量体积比加入预冷的0.86%的生理盐水，然后匀浆，匀浆液经4 000 r/min离心10 min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量。

1.8 数据统计与分析

采用SPSS 19.0统计软件将数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若组内差异达到显著水平(P < 0.05)，则进行Duncan氏法多重比较。数据用平均值±标准误表示。

2 结果 2.1 白藜芦醇对松浦镜鲤生长性能的影响

由表 2可见，与对照组相比，饲料添加160、240和320 mg/kg白藜芦醇组饲料系数显著降低(P < 0.05)，饲料添加240和320 mg/kg白藜芦醇组脏体指数显著降低(P < 0.05)。饲料添加不同水平白藜芦醇对增重率、肥满度和肝体指数无显著影响(P > 0.05)。

2.2 白藜芦醇对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响

由表 3可见，与对照组相比，饲料添加160 mg/kg白藜芦醇组中肠淀粉酶活性显著升高(P < 0.05)，饲料添加240和400 mg/kg白藜芦醇组中肠淀粉酶活性显著降低(P < 0.05)；饲料添加160 mg/kg白藜芦醇组前肠脂肪酶活性显著升高(P < 0.05)，饲料添加80、160和320 mg/kg白藜芦醇组中肠脂肪酶活性显著升高(P < 0.05)；饲料添加80和320 mg/kg白藜芦醇组前肠蛋白酶活性显著升高，饲料添加80、160、240和400 mg/kg白藜芦醇组中肠蛋白酶活性显著升高(P < 0.05)。饲料中添加不同水平白藜芦醇对前肠淀粉酶，后肠淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性均没有显著影响(P > 0.05)。

2.3 白藜芦醇对松浦镜鲤肝脏抗氧化指标的影响

由表 4可见，与对照组相比，饲料添加160 mg/kg白藜芦醇肝脏SOD活性显著升高(P < 0.05)，饲料添加80和160 mg/kg白藜芦醇肝脏CAT活性显著升高(P < 0.05)，饲料添加160和240 mg/kg白藜芦醇肝脏MDA含量显著降低(P < 0.05)。

2.4 白藜芦醇对松浦镜鲤血清生化指标的影响

由表 5可见，与对照组相比，饲料添加160和240 mg/kg白藜芦醇血清AKP显著升高(P < 0.05)，饲料添加320和400 mg/kg白藜芦醇差异不显著(P > 0.05)；饲料添加80、160和320 mg/kg白藜芦醇血清ACP活性显著升高(P < 0.05)，饲料添加400 mg/kg白藜芦醇差异不显著(P > 0.05)。饲料添加不同水平白藜芦醇对血清AST和ALT活性没有显著影响(P > 0.05)。

3 讨论 3.1 白藜芦醇对松浦镜鲤生长性能的影响

增重率是衡量生长状况的一个重要指标，能够直接反映动物生长和增重情况。本试验中，与对照组相比，饲料添加160、240和320 mg/kg白藜芦醇降低了饲料系数，这是由于白藜芦醇具有较强的抑菌作用，在一定程度上具有保障健康、提高饲料利用的作用^[10]。本试验中，饲料添加不同水平的白藜芦醇对鱼体的增重率无显著影响，胡瑶莲等^[11]在生长育肥猪饲粮中添加600 mg/kg白藜芦醇对生长性能无显著影响，这与本试验结果一致。在团头鲂上的研究表明，饲料添加0.04%和0.36%白藜芦醇对特定生长率、平均日采食量和饲料效率均无显著影响，而饲料添加1.08%白藜芦醇组的特定生长率和平均日采食量均显著低于其他各组，且该组团头鲂的饲料效率也低于其他各组^[8]。但饲料添加0.025%~0.100%白藜芦醇对吉富罗非鱼的抑制生长作用较为明显^[9]。试验结果的差异可能与动物品种有关，同时白藜芦醇添加水平对生长性能的影响也较明显，由于白藜芦醇在水生动物上的研究还较少，其确切作用和机理还需更多的试验来证明。

3.2 白藜芦醇对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响

消化酶在生物体的生长代谢过程中起着非常独特和关键的作用，它能催化机体内各种化学变化，为生物体进行一系列的活动提供能量和营养。可以通过测定鱼类的消化酶活性来判断鱼类消化机能。消化酶活性的提高可以增强鱼类对营养物质的消化吸收的能力，进而加快鱼类生长发育的速度^[12-13]。适宜的中草药添加剂可以提高鱼类消化酶活性^[14]。陈苏维等^[15]在泥鳅的饲料中添加中草药(炒神曲、炒山楂和炒麦芽以1 : 1 : 1比例混合煎制成生药浓度为0.1 g/mL的药液)，2%添加量能显著提高泥鳅肝胰脏淀粉酶活性。邱小琮等^[16]研究表明，饲料中添加中草药(山楂、麦芽)能提高异育银鲫肠道蛋白酶和淀粉酶活性。本试验中，白藜芦醇可提高松浦镜鲤肠道淀粉酶活性，饲料添加160 mg/kg白藜芦醇组中肠蛋白酶和脂肪酶活性均显著高于对照组。这表明白藜芦醇可以促进消化酶的分泌，提升营养物质的消化能力。影响鱼类消化吸收能力的主要因素为黏膜褶皱的长短和疏密、纹状缘的发达程度以及杯状细胞数量的多少。在肉鸡饲粮中添加0.1%白藜芦醇显著提高了肉鸡十二指肠、空肠的绒毛高度，提示白藜芦醇能促进肠道生长^[17]。但饲料中添加0.1%白藜芦醇致使吉富罗非鱼肠绒毛失去正常形态，损伤肠道健康^[9]。关于白藜芦醇对肠道发育和消化酶的活性的研究还较少，导致试验结果不同的原因还需要进一步的证明。

3.3 白藜芦醇对松浦镜鲤肝脏抗氧化指标的影响

动物机体在新陈代谢过程中，活性氧自由基的产生和消除维持着动态平衡。生物抗氧化酶系2个重要的酶类分别为SOD和CAT，对生物体内活性氧自由基的清除起关键作用。MDA则是过氧化脂质降解产物，可导致机体细胞损伤，其含量可反映机体内脂质过氧化程度和肝脏损伤指标^[18-20]。检测这些指标可以综合判定生物机体抗氧化和免疫情况。本试验中，饲料添加80~240 mg/kg白藜芦醇能提高肝脏SOD和CAT的活性，降低肝脏MDA含量。卓杰先等^[21]研究发现，白藜芦醇提高运动小鼠肝脏SOD活性，降低肝脏MDA含量。原江水^[22]对老龄大鼠的研究发现，口服适量的白藜芦醇可在不影响其体质量和血液相关指标下，增强其体液免疫应答和细胞免疫应答，从而起到免疫保护作用。在水产方面，团头鲂饲料中添加0.04%、0.36%和1.08%白藜芦醇组血浆MDA的含量显著降低，血浆谷胱甘肽(GSH)含量显著升高^[8]。王庆奎等^[23]用富含白藜芦醇的虎杖饲料喂斑点叉尾鮰发现，富含白藜芦醇的饲料可以提高斑点叉尾鮰肝脏SOD和CAT活性。刘亭亭^[24]在对贡氏假鳃鳉的研究发现，投喂含有白藜芦醇的饲料可以改善生长导致的抗氧化酶活性降低的趋势，提高贡氏假鳃鳉的抗氧化活性，从而增强了抗氧化防御系统清除自由基的能力。以上报道结果与本试验得出适量白藜芦醇的添加水平可提高松浦镜鲤机体抗氧化能力的结论一致，说明白藜芦醇能够提高动物机体的抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应。Rubiolo等^[25]研究发现，经过白藜芦醇处理后的肝细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达水平显著升高，进入细胞核后从而诱导激活细胞抗氧化通路。另外在哺乳动物肝脏受损时，肝脏活细胞内核因子-κB(NF-κB)信号通路会被激活，白藜芦醇干预后，显著提升肝细胞中蛋白激酶B(PKB)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表达水平，并且白细胞介素-1β(IL-1β)生成量和NF-κB的活化水平降低，降低了肝脏的炎症和氧化应激损伤^[26]。以上试验结果表明，白藜芦醇可激活特定的通路发挥其抗氧化作用。白藜芦醇能提高松浦镜鲤肝脏抗氧化能力，说明在松浦镜鲤机体中可能存在与哺乳动物类似的NF-κB活性变化，其作用机理需要进一步的考证。

3.4 白藜芦醇对松浦镜鲤血清生化指标的影响

ACP是作为鱼类体内巨噬细胞溶酶体的标志性酶，在酸性条件下可以参与磷脂的代谢和能量的转化，AKP直接参与磷酸基团的转移及钙、磷代谢，它们也是生物体内重要的解毒体系^[24]。Tao等^[27]研究了白藜芦醇对吞噬细胞中趋化因子受体的影响，发现白藜芦醇在非致毒的浓度下可抑制吞噬细胞对一些趋化因子的趋化反应以及钙离子的释放，微摩尔浓度的白藜芦醇可显著抑制吞噬细胞对甲酰化肽受体(FPR)配体的反应，降低超氧化物阴离子的产生，并抑制FPR激动剂引起的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化和NF-κB的激活。Dong等^[28]研究发现，50 mg /kg白藜芦醇通过上调沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达来抑制IκB激酶磷酸化，从而降低NF-κB的活性，对大鼠肠道缺血再灌注的损伤起缓解作用。郑翔等^[29]研究表明，白藜芦醇能减轻模型动物急性肺损伤，并降低动物血清炎症因子水平。本试验表明，饲料添加160 mg/kg白藜芦醇可以提高ACP和AKP的活性。高妍等^[30]研究发现，不同水平白藜芦醇对乌克兰鳞鲤ACP和AKP活性有不同程度的升高，这与本试验结果一致。这说明白藜芦醇能够提高机体解毒作用。朱立贤等^[31]通过对高脂血症大鼠的研究发现，在酒剂中添加白藜芦醇经口灌胃，能显著增强小鼠细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞功能；饲粮中添加120 mg/kg的白藜芦醇可提高血鹦鹉溶菌酶活性^[32]；饲粮中添加0.1%~0.2%白藜芦醇有利于提高肉仔鸡的免疫功能^[33]。高脂饲料中添加0.04%白黎芦醇，团头鲂血浆总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及ACP活性均显著提高，说明白藜芦醇可提高团头鲂的免疫力^[8]。由于许多炎症是由于体内自由基过多造成的，可以推断白藜芦醇在提升机体抗氧化能力的同时，也会改善机体免疫能力，相关的作用机制有待深入研究。

ALT和AST是鱼类重要的氨基酸转氨酶，在非必需氨基酸的合成和蛋白质分解中起着重要的中介作用，其活性反映了蛋白质合成和分解代谢的状况^[34]。血清中的ALT和AST主要分布于肝细胞内，在机体代谢过程中起着很大的作用。一般情况下，血清中2种转氨酶活性很小。当肝脏受损或损坏，肝细胞中的转氨酶便进入血液，ALT和AST活性升高。因此，可通过测定血清中ALT和AST的活性来衡量肝脏受损情况。本研究中，饲料添加不同水平白藜芦醇对松浦镜鲤的血清ALT和AST活性的影响不显著，说明在试验范围内，白黎芦醇对松浦镜鲤肝脏并未造成影响。投喂40~120 mg/kg白藜芦醇7 d，血鹦鹉肝脏ALT、AST活性与对照组无显著影响^[32]。吴严冰等^[35]研究发现，白藜芦醇可以显著减少力竭运动小鼠肝损伤后血清转氨酶活性升高的情况，可以有效地保护力竭运动小鼠的肝功能。刘颖等^[36]的研究表明，白藜芦醇能降低大鼠血清中ALT、AST活性。高脂饲粮中添加白藜芦醇显著降低小鼠的血清中AST、ALT活性，肝脏中AST、ALT活性也有所升高，表明白藜芦醇可以缓解肥胖造成的肝脏损伤^[37]。以上试验说明白藜芦醇可以缓解肝脏受损的情况，这与本试验结果一致。

4 结论

饲料中添加白藜芦醇能有效提高松浦镜鲤幼鱼的消化酶活性和抗氧化能力，白黎芦醇的适宜添加水平为160 mg/kg。