紫苏籽是紫苏的种子，不但具有润肺、宽肠、下气、清痰等药用价值，还可以用作调味料起去腥、提味等作用。紫苏籽中含大量油脂，而紫苏籽油中含55.24%的亚麻酸、11.87%的亚油酸、20.42%的油酸[1]。紫苏籽提取物的主要成分为亚油酸和亚麻酸等功能性脂肪酸，而功能性脂肪酸具有调控畜禽肉品质的功能，在改善肉品质方面有重要作用[2-3]。肌内脂肪(IMF)含量与肉品嫩度、多汁性和风味等的形成紧密相关[4]，直接决定着牛肉的市场价值[5]。IMF沉积是脂肪酸合成与分解动态博弈的结果，受到脂肪合成基因如过氧化物酶增殖激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)等[6-7]以及脂肪分解基因如肉碱转移酶1(CPT-1)和激素敏感脂肪酶(HSL)等的调控[8-9]。目前有关紫苏籽提取物的研究多集中在其对动物生产性能、胴体品质和免疫功能的影响[10-11]方面，而关于紫苏籽提取物对育肥牛IMF沉积相关基因表达影响的研究较少。因此，本试验旨在研究紫苏籽提取物对育肥牛生产性能、肉品质和IMF沉积相关基因表达的影响，为在育肥牛饲粮中合理添加紫苏籽提取物提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验动物和试验设计选用20头16月龄、体重(415.1±14.49) kg的西杂阉公育肥牛(西门塔尔牛×本地黄牛)，随机分为2组，每组10头。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加0.03%紫苏籽提取物(干物质基础)，即添加0.04‰紫苏籽提取物活性成分(紫苏籽提取物活性成分含量×紫苏籽提取物添加量0.03%)。试验期为120 d。紫苏籽提取物的添加剂量参考张文火[10]和时艺霖[11]的试验。紫苏籽提取物购于重庆优胜发展科技有限公司，其主要活性成分及含量如下：α-亚麻酸≥100.0 g/kg、亚油酸≥20.0 g/kg、黄酮≥16.6 g/kg，其余成分为沸石粉(载体和稀释剂)。参考我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[12]中425 kg体重、日增重1 kg肉牛营养推荐值设计基础饲粮配方，基础饲粮组成及营养水平见表 1。采用逐级预混原则，将紫苏籽提取物首先与粉状精料补充料混合均匀后，再与粗饲料混合均匀，从而制备试验组饲粮。试验牛为每头单栏拴养饲喂，在每天08:00和16:00各饲喂1次。试验期间按照肉牛育肥期常规饲养管理对试验牛进行管理，保持圈舍干净，精料补充料、粗饲料完全混合成全混合日粮(TMR)饲喂，自由采食和饮水。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验期内每10 d采集1次TMR样品，65 ℃烘干后粉碎，过40目筛制备样品，-20 ℃保存待测。TMR样品的干物质(DM)、粗脂肪(EE)和粗蛋白质(CP)含量参照AOAC(1995)[13]中方法测定。参照Van Soest等[14]的方法测定TMR样品的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。
1.2.2 生长性能和屠宰性能测定分别在试验开始和结束时测定全部试验牛体重，根据测定的体重计算出每组试验牛的平均日增重(ADG)。试验期间记录每天饲粮实际饲喂量，每天记录并收集剩余饲粮保存于-20 ℃冰箱，每10 d测定1次投入饲粮和剩余饲粮干物质含量，用于计算每10 d的日均干物质采食量(ADDMI)，根据每10 d的ADDMI计算出整个试验期的ADDMI。根据ADDMI和ADG计算出料重比(F/G)。试验结束后通过测定试验牛的体重，每组选择接近该组平均体重的5头牛进行屠宰。胴体重、净肉重、胴体产肉率和屠宰率的测定参照周光宏等[15]的方法。
1.2.3 肉品质分析试验牛屠宰后，采集背最长肌样品，测定背最长肌pH、剪切力、系水力和IMF含量。背最长肌pH采用上海雷磁pHS-3D型pH计测定。背最长肌剪切力采用Baublits等[16]的方法测定。背最长肌系水力采用Xin等[17]的方法测定。背最长肌IMF含量采用索氏脂肪抽提法测定。
1.2.4 背最长肌脂肪酸代谢关键酶活力测定试验牛屠宰后采集背最长肌样品放入-20 ℃冰箱保存备用，用于脂肪酸代谢关键酶活力测定。试验牛背最长肌HSL、ACC、CPT-1和FAS的活力参考南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行测定。
1.2.5 背最长肌IMF沉积相关基因表达分析试验牛屠宰后立即采集背最长肌样品放入液氮罐中冻存，然后放入-80 ℃超低温冰箱保存备用，用于肌内脂肪沉积相关基因表达分析。参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书提取背最长肌总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳检查其完整性。参照TaKaRa逆转录试剂盒说明书将背最长肌总RNA反转录为cDNA。参照Zhang等[2]的方法合成β-肌动蛋白(β-actin)、PPARγ、SREBP-1、FAS、ACC、CPT-1和HSL基因的特异引物序列。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt相对定量方法计算目的基因的相对表达量。
1.3 统计分析试验数据用Excel 2003处理，采用SPSS 19.0统计软件进行t检验。结果用平均值±标准差表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 生长性能紫苏籽提取物对育肥牛生长性能的影响见表 2。与对照组相比，饲粮中添加紫苏籽提取物对育肥牛初重、末重、ADG、ADFI和F/G均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 紫苏籽提取物对育肥牛生长性能的影响 Table 2 Effects of perilla seed extract on growth performance of fattening cattle |
紫苏籽提取物对育肥牛屠宰性能和肉品质的影响见表 3。与对照组相比，饲粮中添加紫苏籽提取物显著提高了育肥牛背最长肌IMF含量(P < 0.05)，显著降低了背最长肌剪切力(P < 0.05)。与对照组相比，饲粮中添加紫苏籽提取物组对育肥牛胴体重、净肉重、屠宰率、胴体产肉率、背最长肌pH和背最长肌系水力均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 紫苏籽提取物对育肥牛屠宰性能和肉品质的影响 Table 3 Effects of perilla seed extract on slaughter performance and meat quality of fattening cattle |
紫苏籽提取物对育肥牛背最长肌脂肪酸代谢关键酶活力的影响见表 4。与对照组相比，饲粮中添加紫苏籽提取物显著提高了育肥牛背最长肌FAS和ACC的活力(P < 0.05)，显著降低了背最长肌HSL和CPT-1的活力(P < 0.05)。
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表 4 紫苏籽提取物对育肥牛背最长肌脂肪酸代谢关键酶活力的影响 Table 4 Effects of perilla seed extract on fatty acid metabolism key enzyme activities in longissimus dorsi muscle of fattening cattle |
紫苏籽提取物对育肥牛背最长肌IMF沉积相关基因表达的影响见图 1。与对照组相比，饲粮中添加紫苏籽提取物显著提高了育肥牛背最长肌SREBP-1、FAS、ACC和PPARγ基因的相对表达量(P < 0.05)，显著降低了背最长肌HSL和CPT-1基因的相对表达量(P < 0.05)。
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SREBP-1：固醇调节元件结合蛋白-1；PPARγ：过氧化物酶增殖激活受体γ；FAS：脂肪酸合成酶；ACC：乙酰辅酶A羧化酶；HSL：激素敏感脂肪酶；CPT-1：肉碱转移酶-1。数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 SREBP-1: sterol regulator element binding protein-1; PPARγ: peroxidase activation receptor gamma; FAS: fatty acid synthetase; ACC: acetyl coenzyme A carboxylase; HSL: hormone sensitive lipase; CPT-1: carnitine transferase 1. Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). 图 1 紫苏籽提取物对育肥牛背最长肌IMF沉积相关基因表达的影响 Fig. 1 Effects of perilla seed extract on IMF deposition related gene expression in longissimus dorsi muscle of fattening cattle |
本试验中，饲粮中添加紫苏籽提取物对育肥牛的末重、ADG、ADDMI和F/G均无显著影响，这与褚晓红等[18]、张文火[10]的研究结果类似。紫苏籽提取物中除主要活性成分(136.6 g/kg)外，其余大部分为沸石粉(863.4 g/kg)，而沸石粉常作添加剂预混物的载体和稀释剂。本研究中，试验组饲粮是在基础饲粮(干物质基础)中添加0.03%的紫苏籽提取物，与对照组相比添加沸石粉很少，因此紫苏籽提取物的主要活性成分对试验效果起决定性作用。本研究所用紫苏籽提取物的主要活性成分为亚油酸和亚麻酸，相关的研究表明饲粮补充亚油酸和亚麻酸对育肥牛的生长性能无显著影响[2, 19]。本试验结果表明饲粮中添加紫苏籽提取物对育肥牛的生长性能无负面影响。
3.2 紫苏籽提取物对育肥牛屠宰性能和肉品质的影响本试验中，饲粮中添加紫苏籽提取物对育肥牛的屠宰率和胴体产肉率无显著影响。张文火[10]的研究表明，饲粮中添加紫苏籽提取物对育肥牛的屠宰率和胴体产肉率无显著影响，与本试验结果一致。其可能原因是紫苏籽提取物的主要成分为亚油酸和亚麻酸，亚油酸和亚麻油酸进入肉牛瘤胃在微生物的作用下发生位置异构形成共轭亚油酸，而相关的研究表明饲粮补充共轭亚油酸对育肥牛屠宰性能无显著影响[2]。此外，本试验结果表明，饲粮中添加紫苏籽提取物可显著提高育肥牛背最长肌IMF含量，显著降低背最长肌剪切力。张文火[10]研究发现，在饲粮中添加紫苏籽提取可降低育肥牛背最长肌剪切力。赵必迁[20]研究了紫苏籽提取物对杜长大猪屠宰性能和肉品质的影响，结果表明紫苏籽提取物显著提高了肉色评分和IMF含量。这可能是因为紫苏籽提取物中的亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的作用下生成共轭亚油酸，而相关的研究表明饲粮补充共轭亚油酸可改善牛肉嫩度和提高IMF含量[2]。综上，饲粮中添加紫苏籽提取物可提高育肥牛背最长肌的嫩度和IMF含量，从而改善肉品质，提升牛肉价值。
3.3 紫苏籽提取物对育肥牛背最长肌IMF沉积相关基因表达的影响IMF沉积是脂肪酸合成与分解动态博弈的结果，受到脂肪酸合成关键酶和脂肪酸分解关键酶的调控。首先，IMF沉积受到脂肪酸合成关键酶的调控。FAS催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A转变成脂肪酸，它的活力增加可以促进脂肪合成[6]。ACC催化乙酰辅酶A羧合成丙二酰辅酶A，从而进一步合成长链脂肪酸[7]。本研究中，饲粮中添加紫苏籽提取物显著提高了脂肪酸合成关键酶(ACC和FAS)的活力，说明脂肪酸合成能力得到加强，促进IMF沉积。这可能是因为紫苏籽提取物中的亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的作用下生成共轭亚油酸，而饲粮补充共轭亚油酸能够提高背最长肌脂肪酸合成关键酶(ACC和FAS)的活力[2, 21]。脂肪酸合成关键酶受到相应基因表达调控，因此，本试验进一步分析了脂肪酸合成相关基因的表达情况。PPARγ基因可通过调控脂肪代谢相关基因的表达，从而影响脂肪酸合成[6]。SREBP-1正向调控ACC、FAS等脂肪酸合成相关基因的表达，从而影响脂肪酸合成[22]。本研究结果表明饲粮中添加紫苏籽提取上调育肥牛背最长肌脂肪酸合成相关基因(PPARγ、SREBP-1、FAS和ACC)的表达。这可能是因为紫苏籽提取物中的亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的作用下生成共轭亚油酸，而相关的研究表明饲粮补充共轭亚油酸上调背最长肌肪酸合成相关基因(PPARγ、SREBP-1、FAS和ACC)的表达，从而促进IMF沉积[2]。其次，IMF沉积还受到脂肪酸分解关键酶的调控。HSL是脂肪酸分解的关键酶之一，主要负责将甘油三酯水解为游离脂肪酸、甘油和甘油二酯[8]。CPT-1也是脂肪酸分解的关键酶之一，其主要作用是使脂肪酸发生β氧化，从而分解脂肪酸[9]。本研究中，饲粮中添加紫苏籽提取物显著降低了脂肪酸分解关键酶(HSL和CPT-1)的活力，说明脂肪酸分解能力减弱，从而促进IMF沉积。这可能是因为紫苏籽提取物中的亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的作用下生成共轭亚油酸，而饲粮补充共轭亚油酸能降低脂肪酸分解关键酶(HSL和CPT-1)的活力[21, 23]。脂肪酸分解关键酶受到相应基因表达的调控，因此，本试验进一步测定了脂肪分解成相关基因的表达情况。本研究结果表明饲粮中添加紫苏籽提取物下调育肥牛背最长肌脂肪酸分解相关基因(HSL和CPT-1)的表达。这可能是因为紫苏籽提取物中的亚油酸和亚麻酸在瘤胃微生物的作用下生成共轭亚油酸，而相关的研究表明饲粮补充共轭亚油酸下调背最长肌肪酸分解相关基因(HSL和CPT-1)的表达，从而促进IMF沉积[2]。
4 结论饲粮中添加紫苏籽提取物可上调育肥牛背最长肌脂肪酸合成相关基因(SREBP-1、FAS、ACC和PPARγ)的表达，下调脂肪分解相关基因(HSL和CPT-1)的表达，提高脂肪合成关键酶(FAS和ACC)的活力，降低脂肪分解关键酶(HSL和CPT-1)的活力，促进背最长肌IMF沉积，增加牛肉嫩度，从而改善牛肉品质。
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