植物精油是通过萃取等技术从植物中提取出的次生代谢产物，作为抗生素的潜在绿色替代物，在反刍动物生产中具有提高生产性能、调节瘤胃发酵的作用^[1]。大量研究表明，植物精油具有抗菌、抗病毒和抗氧化的特性^[2]。牛至精油(oregano essential oil, OE)是从牛至(Origanum vulgare L.)中提取的挥发油，其活性成分主要是香芹酚、百里酚、松油烯和芳樟醇等物质^[3]。研究表明，牛至精油中含有抗菌、抗氧化成分^[4]，具有非常强的表面活性和脂溶性，能迅速穿透病源微生物的细胞膜，从而使致病微生物水失衡而死亡。另外，其活性成分香芹酚和百里酚能加速胃肠道上皮细胞的更新，减少病原体对肠道上皮细胞的感染，抑制有害菌的生长^[5]。有文献报道，饲粮中添加牛至精油可以减少家兔肠道中细菌总数及特异性病原菌数量^[6]。本团队研究发现，饲粮中添加牛至精油能够改善绵羊瘤胃内环境，维持pH稳定，提高营养物质消化率^[7-8]。由此可以推断，牛至精油可能提高了瘤胃中消化酶的活性，进而提高了营养物质的消化利用。为深入研究牛至精油对绵羊复胃功能的影响，本试验以萨福克×小尾寒羊F1代公羔为研究对象，研究牛至精油对其复胃发育、消化酶活性以及瘤胃微生物区系的影响，为牛至精油在绵羊生产中的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计、饲粮及试验动物

试验选取18只体重相近[(20.30±1.27) kg]、体况良好的3月龄萨福克×小尾寒羊F1代公羔，随机分为3组(每组6只)：对照组(CON组)饲喂基础饲粮，牛至精油组分别饲喂在基础饲粮基础上添加4(EO4组)和7 g/d(EO7组)牛至精油的试验饲粮。试验用牛至精油购自美国Ralco动物营养公司。基础饲粮参考NRC(2007)中体重20 kg、日增重300 g/d的公羊营养需要配制，粗饲料为玉米秸秆青贮饲料(蜡熟期收割的去穂玉米秸秆)，精料主要为玉米、豆粕、菜籽粕、酒糟、预混料等，基础饲粮组成及营养水平见表 1。

1.2 饲养管理

试验共持续82 d，其中预试期10 d，正试期72 d。试验前对羊只进行检疫，预试期进行驱虫、防疫，定期消毒，保证羊舍干净。试验羊单栏饲养，每天分别于07：00和18：00分2次等量饲喂，将牛至精油与精料混匀，先精料后粗料，自由采食、饮水。

1.3 样品采集

在试验最后5 d采用全收粪法收集每头羊的全部粪便，每6 h收粪1次，将每天收集的粪样混匀、称重，取每头羊鲜粪总重的10%，再取鲜粪样500 g加20 mL 10%稀硫酸，混匀。将采集好的粪样置于烘箱中65 ℃烘至恒重。试验结束后，将粪样粉碎后过40目筛，用于粪能的测定。

试验最后1 d采食12 h后，颈静脉放血处死试验羊，迅速取出胃肠道并将各胃室(瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃)结扎分离，称重、测量体积后立即采集复胃内容物至灭菌的冻存管内，保存于-20 ℃，用于消化酶活性的测定，另采集瘤胃液经4层纱布过滤后保存于-80 ℃，用于瘤胃微生物区系的测定。

1.4 测定指标及方法 1.4.1 消化能

饲粮、粪样中总能采用全自动氧弹式测热仪(PARR6300，美国)测定。称取1 g左右制备好的样品，利用全自动氧弹式测热仪分别测定出饲粮总能和粪能，计算消化能。

消化能(MJ/kg)=饲粮总能-粪能。

1.4.2 各胃室重量、容积及其指数

将结扎分离的各胃室投入到有刻度的烧杯中，采用排水法测量各胃室容积，之后清理掉各胃室内容物称重，并计算各胃室重量及容积指数，计算方法如下：

各胃室重量指数(%)=(各胃室重/全胃总重)×100;

各胃室容积指数(%)=(各胃室容积/全胃总容积)×100。

1.4.3 消化酶活性

测定各胃室内容物中5种消化酶(纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶)的活性。测定之前对样品进行匀浆预处理，称取一定量(0.5~1.0 g)的各胃室内容物，按质量体积比1 : 9(g : mL)加入匀浆介质，进行超声粉碎匀浆，制成10%的样品匀浆液，然后将匀浆液用低温低速离心机2 500 r/min离心10 min，取上清液，采用试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)配合WD-2102B型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司生产)测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 瘤胃微生物区系

瘤胃微生物特异性引物见表 2，细菌的引物参照Muyzer等^[9]，真菌、原虫和白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的引物参照周瑞等^[10]，黄色瘤胃球菌的引物参照Koike等^[11]。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

微生物总DNA的提取利用天根(北京)粪样DNA提取试剂盒进行。微生物测定利用Light Cycler^® 480 Ⅱ型荧光定量基因扩增仪采用荧光定量PCR(qPCR)比较阈值法。PCR反应体系及反应参数参照Roche试剂盒(Gat.No.06402712001)说明书进行。PCR反应体系(20 μL)为：Master Mix 10 μL，模板2 μL(20 ng)，上、下游引物各0.6 μL，ddH₂O 6.8 μL。PCR反应参数为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸10 s，45个循环。目的微生物的数量以每个样品中每毫升16S rRNA或18S rRNA基因拷贝数(拷贝数/mL)表示^[12]。

1.5 数据处理

试验数据用Excel 2010建立数据库，通过SPSS 19.0软件中的单因素方差分析对数据进行统计分析和显著性检验，运用LSD法进行多重比较，P < 0.05为差异显著，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 饲粮中添加牛至精油对绵羊各胃室重量、容积及其指数的影响

饲粮中添加牛至精油对绵羊各胃室重量、容积及其指数的影响如表 3所示。结果显示，绵羊瘤胃容积随饲粮中牛至精油添加量的增加显著增大(P < 0.05)；与CON组相比，EO7组瘤胃容积指数提高了2.09%(P < 0.05)，皱胃容积指数下降了1.61%(P < 0.05)。绵羊各胃室重量及重量指数，网胃、皱胃容积及容积指数在3组间均无显著差异(P>0.05)。

2.2 饲粮中添加牛至精油对绵羊复胃消化酶活性的影响

饲粮中添加牛至精油对绵羊复胃消化酶活性的影响如表 4所示。瘤胃、瓣胃中纤维素酶活性随着牛至精油添加量的增加呈上升趋势，且EO4组和EO7组均显著高于CON组(P < 0.05)；与CON组相比，EO4组瓣胃中β-葡萄糖苷酶和瘤胃中胃蛋白酶活性均显著升高(P < 0.05)，其他消化酶活性无显著差异(P>0.05)；EO7组瘤胃、网胃中纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性均显著升高(P < 0.05)，瘤胃中脂肪酶、瓣胃中纤维素酶和皱胃中胃蛋白酶活性均显著升高(P < 0.05)。

2.3 饲粮中添加牛至精油对绵羊瘤胃微生物区系的影响

饲粮中添加牛至精油对绵羊瘤胃微生物区系的影响如表 5所示。与CON组相比，EO4组瘤胃中黄色瘤胃球菌数量升高了6.52%(P < 0.05)；EO7组瘤胃中真菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌数量分别升高了10.05%(P < 0.05)、8.28%(P < 0.05)、8.31%(P < 0.05)和10.24%(P < 0.05)。饲粮中添加牛至精油降低了瘤胃中原虫数量，其中EO4组和EO7组分别较CON组降低了6.57%(P < 0.05)和11.88%(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 饲粮中添加牛至精油对绵羊复胃重量、容积及其指数的影响

绵羊复胃是重要的消化器官之一，其发育程度直接影响到成年后的采食量和消化能力。复胃的质量增加、容积增大以及内部构造的改变是衡量动物发育优劣的重要指标^[13]。本试验结果表明，饲粮中添加4和7 g/d牛至精油均能够显著增加瘤胃容积，但对网胃和瓣胃容积及其容积指数无显著影响，且饲粮中添加7 g/d牛至精油还显著增加了瘤胃容积指数，显著降低了皱胃容积指数，表明添加牛至精油更有利于瘤胃重量增加和容积的增大，尤其是添加7 g/d牛至精油组。梁建勇等^[7]通过瘤胃瘘管羊体内消化试验发现，牛至精油可以显著提高绵羊瘤胃中乙酸和丙酸含量，促进青贮饲料的消化利用。Flatt等^[14]和Yang等^[15]研究表明，粗饲料在瘤胃中的发酵产物乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸有利于促进瘤胃的生长发育。另外，本团队之前的研究发现，牛至精油可以显著提高奶牛的干物质采食量，促进犊牛的生长发育^[16-17]。结合本试验研究结果可以推断，牛至精油一方面利于粗饲料在瘤胃中的发酵，提高发酵产物产量，促进瘤胃的生长发育，另一方面利于对粗饲料的消化吸收，提高干物质采食量，采食量的增加促进了瘤胃容积增大^[18]。反刍动物出生后，皱胃发育最快，瘤胃、网胃发育较慢，瓣胃发育达到成年大小的时间比网胃和瘤胃长^[19]。当瘤胃和网胃发育后，皱胃容积所占比例将迅速降低，对饲料的部分消化作用逐渐被瘤胃所代替。本研究中，皱胃容积指数变化与瘤胃容积指数相反，这也表明牛至精油可以促进瘤胃快速发育，尤其是添加7 g/d牛至精油时，此时瘤胃容积显著增大，占整个复胃体积的比例显著升高，相应的皱胃容积指数降低。因此，皱胃容积指数显著降低的主要原因可能是由瘤胃容积显著增大造成的。

3.2 饲粮中添加牛至精油对绵羊复胃消化酶活性和瘤胃微生物区系的影响

羔羊刚出生时，瘤胃是无消化功能的，其组织尚未发育，且缺少微生物群，不能分泌消化酶，靠皱胃与小肠分泌消化酶来分解脂肪、碳水化合物与蛋白质^[20]。56日龄羔羊瘤胃发育基本趋于成熟，瘤胃进入反刍阶段，此时消化分解食物主要靠瘤胃微生物分泌的各种消化酶来完成^[21]。瘤胃内的消化酶活性在反刍阶段变化不明显，纤维素酶的活性较稳定^[22]；80~200日龄阶段，α-淀粉酶的活性呈曲线变化，蛋白酶和脂肪酶活性呈上升趋势^[23]。研究表明，瘤胃中消化酶活性与瘤胃微生物的数量和代谢密切相关^[24]。本研究发现，饲粮中添加7 g/d牛至精油显著增加了瘤胃中真菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌数量。真菌可以穿透细胞壁，通过降解木质素增强纤维素降解率，黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃中主要的纤维分解菌^[25]，因此，真菌、纤维分解菌数量升高，分泌的纤维素酶、β-葡萄糖苷酶活性得到增强^[26]，可以促进对纤维素的降解，这与本团队前期的研究得出的中性洗涤纤维素消化率提高的结果相吻合^[8]。有研究发现，添加0.33 ml/L的薄荷油可以使培养液中真菌数量提高4倍^[27]。Patra等^[28]研究发现，混合植物精油(香兰素、奎尔兰皂苷和香精油)可以显著提高体外瘤胃液中产琥珀酸丝状杆菌数量。这些研究与本试验结果一致。Lin等^[29]研究表明，饲粮中添加混合植物精油(丁香油、牛至油、肉桂油和柠檬油)对瘤胃真菌数量无显著影响。McIntosh等^[30]研究表明，植物精油混合物(百里香酚、丁香酚、香草醛和柠檬烯)添加量大于20 mg/L时显著抑制了奶牛瘤胃微生物中真菌的生长繁殖。以上研究结果与本研究结果不同，这可能是混合植物精油间的互作造成的，不同的植物精油其功能不同，对瘤胃微生物的影响各异。

原虫约占反刍动物瘤胃生物量的50%，其对瘤胃中营养物质的降解、细菌种群的维持以及最终减少甲烷排放具有重要作用。Thao等^[31]研究表明，添加桉树油能够降低原生动物的数量。最近的一项研究表明，添加椰子油可以减少40%的原虫数量^[32]，这与本研究结果相似。但是McIntosh等^[30]研究表明，饲粮中添加1 g/d混合植物精油(草酚、丁香酚、香草醛和柠檬烯)对奶牛瘤胃中原虫数量无显著影响。另外，饲粮中添加0.11 g/d混合植物精油(百里酚、石榴油酚和柠檬烯)对绵羊瘤胃原虫数量无显著影响^[33]。以上结果与本研究结果不一致，可能是由于植物精油的化学结构、活性成分以及添加剂量不同造成的。细菌是瘤胃中数量最多的一类微生物，可以分解纤维、蛋白质、淀粉等营养物质。瘤胃中细菌总数是衡量瘤胃细菌稳态的重要指标。Patra等^[34]在体外研究中发现，添加0.25 g/L的牛至精油对细菌总数无显著影响，而添加1.00 g/L时则可以显著降低细菌总数。本研究中，添加4和7 g/d牛至精油对瘤胃细菌总数均无显著影响，这表明4和7 g/d的牛至精油添加量都在瘤胃细菌的耐受范围内，细菌总数处于稳定状态。因此，植物精油的种类、添加量也是影响瘤胃微生物区系的一个重要因素。

反刍动物前胃中的各种消化酶都是由微生物产生的，这些微生物产生的酶的活性主要取决于微生物种群类型、数量及微生物区系的发育状况^[19]，因此可以推断牛至精油对前胃中消化酶活性的影响主要是通过对微生物区系的影响造成的。本试验中，添加7 g/d牛至精油显著提高了皱胃中胃蛋白酶活性，这可能是牛至精油可以提高绵羊采食量^[16]，使进入皱胃的食糜增加，刺激皱胃分泌胃蛋白酶所致^[35]。Williams等^[36]研究表明，刺激皱胃分泌的主要原因是动物因采食使迷走神经活性降低。有关刺激皱胃分泌消化酶的机理有待进一步研究。

4 结论

① 饲粮中添加牛至精油有利于绵羊瘤胃的快速发育，促进其容积增大。

② 饲粮中添加牛至精油能够改善绵羊瘤胃微生物区系，增强瘤胃消化酶的活性。

③ 综合认为，饲粮中添加7 g/d牛至精油更有利于促进绵羊瘤胃发育，改善瘤胃微生物区系，增强瘤胃消化酶活性。