不同青贮菌、纤维分解酶及碳源组合对稻秸青贮发酵品质的影响

引用本文

欧阳佳良, 戚如鑫, 陈逸飞, 王梦芝. 不同青贮菌、纤维分解酶及碳源组合对稻秸青贮发酵品质的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(4): 1952-1960.

OUNGYANG Jialiang, QI Ruxin, CHEN Yifei, WANG Mengzhi. Effects of Different Combinations of Silage Bacteria, Cellulolytic Enzymes and Carbon Sources on Fermentation Quality of Rice Straw Silage[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(4): 1952-1960.

不同青贮菌、纤维分解酶及碳源组合对稻秸青贮发酵品质的影响

欧阳佳良, 戚如鑫, 陈逸飞, 王梦芝

扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009

收稿日期: 2018-09-12

基金项目: 国家重点研发计划(2017YFD0800200, 2018YFD0502100);江苏省优势学科(PAPD)

作者简介: 欧阳佳良(1996-), 男, 江西九江人, 硕士研究生, 从事动物营养与饲料科学研究。E-mail:2856847623@qq.com

通信作者: 王梦芝, 教授, 博士生导师, E-mail:mengzhiwangyz@126.com.

摘要: 本试验旨在研究不同添加物组合对稻秸青贮发酵品质的影响，进而筛选出最适于稻秸青贮的添加物组合。采用3因素3水平正交设计，将不同种类的青贮菌、纤维分解酶和碳源添加到稻秸中，1组为地衣芽孢杆菌+黑曲霉+葡萄糖，2组为地衣芽孢杆菌+绿色木霉+麸皮，3组为地衣芽孢杆菌+纤维素酶+淀粉，4组为植物乳杆菌+黑曲霉+麸皮，5组为植物乳杆菌+绿色木霉+淀粉，6组为植物乳杆菌+纤维素酶+葡萄糖，7组为粪肠球菌+黑曲霉+淀粉，8组为粪肠球菌+绿色木霉+葡萄糖，9组为粪肠球菌+纤维素酶+麸皮，同时设置空白对照组，共10组，每组3个重复，于青贮15、30和45 d分别采集青贮饲料样品进行青贮发酵品质分析。结果表明：1）2、4组氨态氮（NH₃-N）/总氮（TN）平均值显著高于空白对照组（P < 0.05），9组NH₃-N/TN平均值与空白对照组差异不显著（P>0.05），其他各组均显著低于空白对照组（P < 0.05）。2）除1、3组外，其他各组乳酸含量平均值均显著高于空白对照组（P < 0.05），除1、3组外，其他各组乙酸含量平均值均显著低于空白对照组（P < 0.05），除6、7、8组外，空白对照组丁酸含量平均值显著高于其他各组（P < 0.05）。3）4~9组总评分平均值显著高于空白对照组和其他各组（P < 0.05），1、3组总评分平均值与空白对照组没有显著差异（P>0.05）。4）正交分析中，青贮15、30和45 d极差值青贮菌>纤维分解酶，青贮15和45 d极差值纤维分解酶>碳源，且青贮15和30 d都以植物乳杆菌和绿色木霉水平最优，而青贮30和45 d都以麸皮水平最优。综上，对稻秸青贮品质的影响青贮菌>纤维分解酶>碳源，正交筛选最适于稻秸青贮的添加物组合为植物乳杆菌、绿色木霉和麸皮。

关键词: 青贮稻秸青贮菌纤维分解酶碳源青贮品质正交设计

Effects of Different Combinations of Silage Bacteria, Cellulolytic Enzymes and Carbon Sources on Fermentation Quality of Rice Straw Silage

OUNGYANG Jialiang, QI Ruxin, CHEN Yifei, WANG Mengzhi

College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Corresponding author: WANG Mengzhi, professor, E-mail:mengzhiwangyz@126.com.

Abstract: The purpose of this experiment was to study the effects of different additives on the fermentation quality of rice straw silage, and then select the most suitable additive combination for rice straw silage. This experiment is an orthogonal test included 3 factors and 3 levels, adding different silage bacteria (Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis), cellulolytic enzymes (Aspergillus niger, Trichoderma viride and cellulase) and carbon source (glucose, bran and starch) to freshly harvested rice straw for silage 45 days, and a blank control group was included. Group 1 was Bacillus licheniformis+Aspergillus niger+glucose, group 2 was Bacillus licheniformis+Trichoderma viride+bran, group 3 was Bacillus licheniformis+cellulase+starch, group 4 was Lactobacillus plantarum+Aspergillus niger+bran, group 5 was Lactobacillus plantarum+Trichoderma viride+starch, group 6 was Lactobacillus plantarum+cellulase+glucose, group 7 was Enterococcus faecalis+Aspergillus niger+starch, group 8 was Enterococcus faecalis+Trichoderma viride+glucose, and group 9 was Enterococcus faecalis+cellulase+bran. Samples were collected for analyzing the fermentation quality on 15, 30 and 45 days of silage. The results showed as follows:1) the mean of ammoniacal nitrogen (NH₃-N)/total nitrogen (TN) in groups 2 and 4 was significantly higher than that in blank control group (P < 0.05), the mean of NH₃-N/TN in group 9 had no significant difference compared with blank control group (P>0.05), and the mean in the other groups was significantly lower than that in blank control group (P < 0.05). 2) Except groups 1 and 3, the mean of lactic acid content in other groups was significantly higher than that in blank control group (P < 0.05); except groups 1 and 3, the mean of acetic acid content in other groups was significantly lower than that in blank control group (P < 0.05); except groups 6, 7, 8 groups, the mean of butyric acid content in blank control group was significantly higher than that in other groups (P < 0.05). 3) The mean of total scores in groups 4 to 9 was significantly higher than that in blank control group and other groups (P < 0.05), that in groups 1 and 3 had no significant difference compared with blank control group (P>0.05). 4) As for orthogonal analysis, the R value was silage bacteria>cellulolytic enzymes at 15, 30 and 45 days of silage. At 15 and 45 days of silage, the R value was cellulolytic enzymes>carbon sources, and Lactobacillus plantarum and Trichoderma viride were the excellent level at 15 and 30 days of silage, while bran was the excellent level at 30 and 45 days of silage. In summary, the effect on silage quality is silage bacteria > cellulolytic enzymes > carbon source, and the most suitable additives combination for rice straw silage is Lactobacillus plantarum, Trichoderma viride and bran.

Key words: silage rice straw silage bacteria cellulolytic enzymes carbon source fermentation quality orthogonal design

稻草秸秆中含有大量的粗纤维类碳水化合物，可作为草食性家畜的重要粗饲料资源，但稻秸粗蛋白质含量较低，表皮角质层严密，导致其适口性差，动物消化利用率低^[1]。青贮不仅能够促进稻秸中粗纤维转化为糖类物质，提高营养价值，还能改善其适口性^[2]。但稻秸表面富含蜡质层和二氧化硅，茎叶上自然附着乳酸菌少，且其可溶性碳水化合物(WSC)含量很低，单独青贮很难制成优质的青贮饲料^[3]。近几年，国内外大量的研究表明添加物能够大大提升稻秸的青贮品质^[4]。目前青贮常用的添加物有青贮菌、纤维分解酶和碳源。青贮菌能够降解利用稻秸中丰富的粗纤维结构，并发酵产生乳酸，降低青贮饲料pH，从而抑制有害菌的生长^[5]。纤维分解酶可以降解秸秆细胞壁结构，为青贮菌发酵提供更多的底物^[6]。稻秸中WSC含量很低，而碳源物质富含WSC，青贮时添加碳源能促进青贮菌生长繁殖，提高发酵品质^[7]。不仅如此，越来越多的研究证明相较于单一添加物，不同添加物组合使用能显著提高青贮发酵品质^[8]。郭海明等^[9]曾报道同时添加青贮菌、纤维分解酶和碳源能更好地提升稻秸青贮品质。但青贮菌、纤维分解酶和碳源种类繁多，且不同添加物的青贮效果有很大差异，而目前有关最适合于稻秸青贮的添加物种类或组合的研究几乎没有。本试验参考大量稻秸青贮添加物的研究确定以青贮菌(地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌)、纤维分解酶(黑曲霉、绿色木霉、纤维素酶)和碳源(葡萄糖、麸皮、淀粉)进行稻秸青贮的3因素3水平正交试验，以探索不同添加物组合对稻秸青贮发酵品质的影响，筛选出最适宜稻秸青贮的添加物组合，为稻草资源合理开发利用提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

黑曲霉购于鹤壁市百惠生物科技有限公司；绿色木霉、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌及植物乳杆菌购于广州绿辉生物科技有限公司；麸皮、葡萄糖和淀粉购于国药集团药业股份有限公司；纤维素酶购于湖南鸿鹰祥生物工程股份有限公司。

于2016年10月在江苏省苏北农用稻田内收割的新鲜水稻(淮粳5)秸秆。鲜稻秸均呈草绿色且具草香味，质地柔韧。鲜稻秸的含水量为63.55%，以风干基础计，稻秸中粗蛋白质含量为5.86%，中性洗涤纤维含量为71.63%，酸性洗涤纤维含量为40.54%，WSC含量为4.68%。

1.2 试验设计

采用L₉(3³)正交试验设计对稻秸青贮最适添加物组合进行筛选，正交试验设计见表 1，共9个试验组，同时设置1个空白对照组，每组3个重复。青贮菌(A)添加量：地衣芽孢杆菌(12.0×10⁷ CFU/g)、植物乳杆菌(8.0×10⁵ CFU/g)、粪肠球菌(6.0×10⁵ CFU/g)；纤维分解酶(B)添加量：黑曲霉(3.0×10⁶ CFU/g)、绿色木霉(6.0×10⁵ CFU/g)、纤维素酶(60 U/g)；碳源(C)添加量：葡萄糖(20 mg/g)、麸皮(20 mg/g)、淀粉(90 mg/g)。各添加物的添加量均参照所购产品公司推荐最适宜青贮的添加量。

表 1 稻秸青贮条件L₉(3³)正交试验设计 Table 1 Orthogonal experiment design L₉ (3³) of silage conditions for rice straw

将鲜稻秸用铡草机铡成3~5 cm，混合均匀后取200 g鲜样于30 cm×500 cm真空包装袋(美吉斯)中，将试验所用青贮菌、纤维分解酶溶于4 mL超纯水中，均匀喷洒在稻秸上，对照组均匀喷洒等量的超纯水，再用真空机(美吉斯)将真空袋抽成真空，于20~22 ℃下贮存，青贮时间为45 d。青贮发酵期每隔15 d采集1次样品，采集完继续发酵。

1.3 样品采集与青贮发酵品质测定

分别于稻秸青贮15、30和45 d现场开包进行青贮饲料感官评定^[10]。取30 g青贮饲料样品放入200 mL的广口三角瓶中，加120 mL超纯水后加塞，置于4 ℃冰柜中浸提24 h，每隔2 h摇晃1次。浸提后将浸提液通过定量滤纸过滤，立即使用上海雷磁Phs-3C型精密pH计测定滤液pH。浸提液样品的氨态氮(NH₃-N)含量采用苯酚－次氯酸钠法测定^[11]；总氮(TN)含量采用凯氏定氮法测定^[12]；有机酸(乳酸、乙酸和丁酸)含量采用气相色谱法测定^[13-14]，总有机酸为乳酸、乙酸和丁酸含量之和。依据《青贮饲料质量评定标准》将NH₃-N/TN得分和有机酸得分(乳酸、乙酸和丁酸得分之和除以2)相加得到青贮发酵品质总评分^[10]。

1.4 数据分析

采用Excel 2016整理原始数据，采用SPSS 13.0软件进行双因素方差分析和Duncan氏多重比较，P < 0.05表示差异显著。采用极差分析法和综合平衡法对青贮发酵品质总评分进行正交分析，ki为该因素i(i=1，2，3)水平的平均值，ki越大，说明该水平越优，极差(R)为该因素ki中最大值与最小值之差，极差越大表明该因素对青贮品质的影响越大^[15]。

2 结果与分析 2.1 稻秸青贮饲料的pH和NH₃-N/TN

由表 2可知，青贮天数、添加物和青贮天数与添加物交互作用对青贮饲料pH以及NH₃-N/TN均有显著影响(P < 0.05)。相同青贮天数不同组间，空白对照组pH平均值显著高于其他组(P < 0.05)，且1~3组pH平均值均显著高于4~9组(P < 0.05)；2、4组NH₃-N/TN平均值显著高于对照组(P < 0.05)，9组NH₃-N/TN平均值与空白对照组差异不显著(P>0.05)，其他各组均显著低于空白对照组(P < 0.05)，且以6、8组最低。相同组不同青贮天数间，4~9组青贮15、30 d的pH均显著低于青贮45 d(P < 0.05)；6、7、8组青贮30 d的NH₃-N/TN均显著低于青贮15和45 d(P < 0.05)。

表 2 稻秸青贮饲料pH和NH₃-N/TN Table 2 pH and NH₃-N/TN of rice straw silages

项目 Items	组别 Groups	青贮天数Ensiling days/d			平均值 Mean	SEM	P值P-value
项目 Items	组别 Groups	15	30	45	平均值 Mean	SEM	D	T	D×T
pH	空白对照Blank control	4.30^aC	4.52^aB	4.62^aA	4.48^a	0.003	*	*	*
	1	4.06^cB	4.54^aA	4.59^abA	4.39^b
	2	4.16^bC	4.28^bB	4.36^cA	4.27^c
	3	4.18^bB	4.48^aA	4.55^bA	4.40^b
	4	4.04^cB	4.08^cB	4.16^fA	4.09^e
	5	3.90^efB	3.91^dB	4.02^gA	3.94^g
	6	3.86^fB	3.82^eB	3.96^hA	3.88^h
	7	3.98^dC	4.12^cB	4.20^eA	4.10^e
	8	3.94^deC	4.06^cB	4.16^efA	4.05^f
	9	4.04^cC	4.13^cB	4.28^dA	4.15^d
氨态氮/总氮 NH₃-N/TN/%	空白对照Blank control	2.47^bc	2.43^c	2.79^b	2.56^b	0.040	*	*	*
	1	1.66^dA	1.34^defB	1.34^dB	1.45^d
	2	3.75^aB	5.14^aA	4.57^aAB	4.49^a
	3	1.56^dA	1.08^efB	1.51^cdA	1.38^d
	4	3.77^a	4.22^b	5.26^a	4.42^a
	5	1.62^d	1.31^def	1.40^cd	1.45^d
	6	0.81^eA	0.34^gB	0.73^dA	0.63^e
	7	2.08^cdA	1.43^deB	2.43^bA	1.98^c
	8	0.89^eB	0.63^fgC	1.14^dA	0.89^e
	9	2.80^bA	1.87^cdB	2.12^bcB	2.26^bc
数据肩标不同小写字母表示相同青贮天数时不同组间的差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示相同组在不同青贮天数的差异显著(P < 0.05)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表 3、表 4同。 Values with different small letter superscripts mean significant difference among groups in the same ensiling days (P < 0.05), with different capital letter superscripts mean significant difference among ensiling days in the same group (P < 0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 3 and Table 4. D：青贮天数；T：添加物；D×T：青贮天数与添加物交互作用。表示差异显著(P < 0.05)，NS表示差异不显著(P>0.05)。表 3、表 4同。D: ensiling days; T: additives; D×T: interaction of ensiling days and additives. : the difference was significant (P < 0.05), NS: the difference was not significant (P>0.05). The same as Table 3 and Table 4.

表 2 稻秸青贮饲料pH和NH₃-N/TN Table 2 pH and NH₃-N/TN of rice straw silages

表 3 稻秸青贮饲料有机酸含量 Table 3 Organic acid contents of rice straw silages

%
项目 Items	组别 Groups	青贮天数Ensiling days/d			平均值 Mean	SEM	P值P-value
项目 Items	组别 Groups	15	30	45	平均值 Mean	SEM	D	T	D×T
乳酸 Lactate acid	空白对照Blank control	48.08^e	45.67^f	54.45^cd	49.40^d	0.730	*	*	*
	1	26.24^fB	51.72^fA	48.14^deAB	42.04^e
	2	52.22^deB	66.65^deA	64.65^bcA	61.18^c
	3	56.24^cdeA	57.64^efA	35.75^eB	49.88^d
	4	64.55^bcB	73.48^bcdA	62.34^cdB	66.79^c
	5	80.52^aB	82.47^abcB	91.36^aA	84.78^a
	6	87.24^a	84.05^ab	79.12^ab	83.47^a
	7	68.32^bB	88.01^aA	64.27^bcB	73.53^b
	8	84.00^aA	72.92^bcdAB	67.32^bcB	74.75^b
	9	59.07^bcdB	70.62^cdA	69.15^bcA	66.28^c
乙酸 Acetic acid	空白对照Blank control	45.97^bc	49.31^a	41.25^bc	45.51^b	0.680	*	*	*
	1	73.12^aA	47.49^aB	49.63^bB	56.75^a
	2	46.86^bA	31.74^bcB	32.30^cdeB	36.97^c
	3	41.49^bcdB	38.64^abB	63.72^aA	47.95^b
	4	35.39^cdA	25.99^cB	36.54^cdA	32.64^c
	5	18.76^eA	14.66^dA	8.21^fB	13.88^e
	6	12.12^eB	9.01^dB	20.18^efA	13.77^e
	7	30.61^dA	11.47^dB	27.83^deA	23.31^d
	8	15.74^eB	26.62^cA	25.31^deA	22.56^d
	9	40.75^bcdA	29.01^bcB	28.17^deB	32.64^c
丁酸 Butyric acid	空白对照Blank control	4.61^a	5.03^ab	4.30^abc	4.65^a	0.225	*	*	*
	1	0.64^bcB	0.79^bB	2.23^cA	1.22^bc
	2	0.91^bcB	1.61^bAB	3.05^bcA	1.86^bc
	3	2.27^bAB	3.72^abA	0.53^cB	2.17^bc
	4	0.06^cB	0.53^bB	1.11^cA	0.57^c
	5	0.72^bcB	2.88^abA	0.42^cB	1.34^bc
	6	0.64^bcB	6.94^aA	0.70^cB	2.76^abc
	7	1.07^bcB	0.52^bB	7.90^aA	3.16^ab
	8	0.26^cB	0.46^bB	7.36^abA	2.70^abc
	9	0.18^cB	0.37^bB	2.68^bcA	1.08^bc

表 3 稻秸青贮饲料有机酸含量 Table 3 Organic acid contents of rice straw silages

表 4 稻秸青贮饲料的发酵品质总评分 Table 4 Fermentation quality total scores of rice straw silages

2.2 稻秸青贮饲料的有机酸含量

由表 3可知，青贮天数、添加物和青贮天数与添加物交互作用对青贮饲料有机酸含量均有显著影响(P < 0.05)。相同青贮天数不同组间，除1、3组外，其他各组乳酸含量平均值均显著高于空白对照组(P < 0.05)，除1、3组外，而其他各组乙酸含量平均值均显著低于空白对照组(P < 0.05)，除6、7、8组外，空白对照组丁酸含量平均值显著高于其他各组(P < 0.05)；5、6、8组在青贮15 d时乳酸含量显著高于其他组(P < 0.05)，而乙酸含量均显著低于其他组(P < 0.05)。相同组不同青贮天数间，1、4、7、8、9组青贮45 d的丁酸含量均显著高于15和30 d(P < 0.05)，且15和30 d之间没有显著差异(P>0.05)。

2.3 稻秸青贮饲料的发酵品质总评分

由表 4可知，青贮天数、添加物和青贮天数与添加物交互作用对青贮饲料的发酵品质总评分均有显著影响(P < 0.05)。相同青贮天数不同组间，4~9组总评分平均值显著高于空白对照组和其他各组(P < 0.05)，1、3组总评分平均值与空白对照组没有显著差异(P>0.05)。相同组不同青贮天数间，3、4、7组青贮45 d总评分均显著低于青贮30 d(P < 0.05)，且数值上，1~4和7~9组都是青贮45 d小于30 d。

2.4 稻秸青贮品质总评分的正交分析

正交分析表 5中，在青贮15、30和45 d，只有A因素的3水平之间都存在显著差异，且都是k2显著大于k1(P < 0.05)，k3也有大于k1的趋势。青贮15 d对发酵品质的影响A>B>C，且各因素的最优水平分别为A2、B2和C3，最优组合为A2B2C3；青贮30 d对发酵品质的影响A>C>B，各因素中最优水平分别为A3、C2和B2，最优组合为A3C2B2；青贮45 d对发酵品质的影响A>B>C，各因素中最优水平分别为A2、B2和C2，最优组合为A2B2C2。

表 5 稻秸青贮品质总评分正交分析 Table 5 Orthogonal analysis of fermentation quality total scores of rice straw silages

组别 Groups		因素Factors			青贮天数Ensiling days/d
组别 Groups		A	B	C	15	30	45
1		1	1	1	74.83	85.67	81.33
2		1	2	2	87.00	90.33	88.83
3		1	3	3	85.67	86.17	77.67
4		2	1	2	95.00	96.17	89.17
5		2	2	3	98.00	95.00	98.50
6		2	3	1	98.00	92.00	96.83
7		3	1	3	93.33	98.83	87.83
8		3	2	1	99.33	96.67	89.67
9		3	3	2	91.83	96.00	91.33
青贮天数Ensiling days/d
15	k1	82.50^b	87.72	90.72
	k2	97.00^a	94.78	91.28
	k3	94.83^a	91.83	92.33
	极差R	14.50	7.06	1.61
30	k1	87.39^b	93.56	91.45
	k2	94.39^a	94.00	94.17
	k3	97.17^a	91.39	93.33
	极差R	9.78	2.61	2.72
45	k1	82.61^b	86.11	89.28
	k2	94.83^a	92.33	89.78
	k3	89.61^ab	88.61	88.00
	极差R	12.22	6.22	1.78
k表示不同添加物不同组青贮品质总评分的均值，在不同列中，k1分别为地衣芽孢杆菌、黑曲霉、葡萄糖的均值；k2分别为植物乳杆菌、绿色木霉、麸皮的均值；k3分别为粪肠球菌、纤维素酶、淀粉的均值。极差(R)为k1~k3值中最大值与最小值之差，极差越大表明该添加物对青贮品质影响越大。 k represents the mean silage quality total scores of different additives in each group. In different columns, k1 are mean total scores of Bacillus licheniformis, Aspergillus niger and glucose, respectively. k2 are Lactobacillus plantarum, Trichoderma viride and wheat bran, respectively. k3 are Enterococcus faecalis, cellulose enzyme and starch, respectively. The R value represents the difference between the maximum and minimum from k1 to k3, and the effects of additives on silage quality are higher if R value are higher.

表 5 稻秸青贮品质总评分正交分析 Table 5 Orthogonal analysis of fermentation quality total scores of rice straw silages

3 讨论 3.1 不同添加物对稻秸青贮饲料pH和NH₃-N/TN的影响

pH决定了青贮饲料最终发酵品质的好坏及其营养损失的情况，一般认为，pH在4.2以下即为青贮成熟^[16]。本试验中，添加物组在青贮15 d时pH就已经低于4.2，并在青贮30和45 d维持较低状态，而空白对照组pH一直高于4.2，说明添加物能够加快青贮成熟。且4~9组pH低于1~3组，说明4~9组青贮效果较好，可能是因为植物乳杆菌或粪肠球菌对稻秸青贮的效果要优于地衣芽孢杆菌。植物乳杆菌、粪肠球菌和地衣芽孢杆菌分别属于乳杆菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属，这些菌属都是目前用于生产乳酸的主要菌属^[17]。韩吉雨^[18]利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析青贮发酵体系中青贮菌多样性时发现，青贮发酵过程中乳杆菌属和肠球菌属居多，说明乳杆菌属和肠球菌属在青贮发酵过程中具有很大的优势。

NH₃-N含量能够反映出微生物分解青贮饲料中蛋白质的情况，含量越小说明饲料中被微生物降解的蛋白质越少，青贮品质越好^[19]。本试验中，空白对照组NH₃-N/TN一直处在较高的水平，说明原始状态的青贮效果不佳。而2、4、9组的NH₃-N/TN也很高可能是因为麸皮中蛋白质含量较高，有利于一些利用蛋白质的梭菌或腐败菌的生长繁殖，从而加速青贮饲料中蛋白质的分解。6、8组NH₃-N/TN在3个时间点都最低说明添加葡萄糖可以有效保护青贮饲料中蛋白质被分解，而同样添加葡萄糖的1组中NH₃-N/TN还是较高，是因为pH较高，不能很好地抑制腐败菌。

3.2 不同添加物对稻秸青贮饲料有机酸含量的影响

青贮饲料中有机酸含量十分重要，青贮菌可降解饲料中的碳水化合物并转化为乳酸，乳酸含量越高，青贮饲料pH越低，进而抑制霉菌的生长繁殖，提高青贮品质。Kung等^[20]曾提出高含量的乙酸可以大大提高青贮饲料的有氧稳定性。所以，乙酸含量可以作为判断青贮饲料有氧稳定性的重要依据。青贮饲料发酵过程中，一些不良微生物可以通过分解饲料中的糖类或发酵产生的乳酸生成丁酸，这种不良的发酵模式往往还会促进饲料中的蛋白质降解，大大降低青贮饲料的品质。

在本试验中，只有1、3组的乳酸含量低于空白对照组，再次说明添加地衣芽孢杆菌的青贮效果没有其他2种青贮菌好，而同样添加了地衣芽孢杆菌的2组乳酸含量较高，可能是因为绿色木霉能够产生多种具有生物活性的酶系和抑制有害微生物生长的抗菌肽^[21]，从而促进地衣芽孢杆菌发酵产生乳酸。而除了空白对照组以外，1、3、5、6、7、8组丁酸含量很高，可能是因为淀粉和葡萄糖能够促进丁酸菌的生长繁殖，丁酸菌再利用葡萄糖和淀粉产生大量的丁酸^[22]。研究中还发现，青贮天数对稻秸青贮品质具有显著的影响，其中乳酸含量随青贮天数的变化趋势与NH₃-N/TN和乙酸含量正好相反，在青贮30 d时最高。Zhao等^[23]试验中的NH₃-N和乳酸含量变化规律与本试验一致，综合各个指标以及总评分指示稻秸青贮的时间不宜过长，30 d左右青贮品质最佳。

3.3 不同添加物对稻秸青贮发酵品质总评分的影响及其正交分析

青贮品质总评分能够综合、直观地反映青贮饲料品质的好坏。本试验中4~9组的青贮品质总评分显著高于1~3组，充分说明地衣芽孢杆菌不适用于稻秸青贮。正交设计主要针对于研究多因素多水平试验，可以实现以最少的试验次数得到与全面试验等效的结果^[24]。本试验对稻秸青贮品质总评分进行正交分析，青贮15、30和45 d的最优组合分别为A2B2C3、A3C2B2和A2B2C2。各时间点的最优组合不同，但青贮3个时间点都是因素A的极差最大，且青贮15和45 d时都是因素B的极差大于因素C，说明对青贮发酵品质总评分的影响A>B>C。水平上，当因素A和B分别取A2和B2时，青贮15和45 d都是最优的结果，而当因素C取C2时，青贮30和45 d都是最优的结果，综合正交分析与各添加物对青贮饲料品质影响的考虑，最优组合为A2B2C2，即植物乳杆菌、绿色木霉和麸皮。

4 结论

① 本试验青贮品质总评分正交分析表明，添加物对稻秸青贮发酵品质影响的顺序为：青贮菌>纤维分解酶>碳源。

② 在本试验的青贮菌添加物中，植物乳杆菌和粪肠球菌比地衣芽孢杆菌适宜用于稻秸青贮发酵，而且稻秸青贮品质在青贮30 d时最好。

③ 本试验中，相对有利于提高稻秸青贮发酵品质的添加物组合为：植物乳杆菌、绿色木霉和麸皮。

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