2. 临沂大学农林科学学院, 临沂 276005
2. College of Agriculture and Forestry Sciences, Linyi 276005, China
肉鸡体内脂肪(尤其是腹脂)含量增加，不仅会降低饲料转化率和经济效益，而且还会严重影响鸡肉品质。动物脂肪沉积主要受遗传、营养及某些调控作用因子的影响。叶酸作为一种重要的水溶性B族维生素，是动物生长发育的必需维生素之一，也是甲基循环中关键的甲基供体[1-2]，它在细胞分化、增殖、修复中发挥着重要作用[3-5]。因此，探明叶酸调控肝脏脂肪代谢基因表达的机理，可为家禽生产中叶酸的合理应用提供参考。研究表明，叶酸能调控糖尿病小鼠β-肾上腺素蛋白的表达和脂肪分解[6]。如果限制母体或围产期大鼠叶酸或维生素B12的摄入量，子代大鼠脂肪细胞的功能会发生改变，从而导致子代大鼠内脏脂肪发生沉积，发病率升高[7]。在绵羊上的研究发现，性成熟母羊怀孕前食物中叶酸摄入量减少会导致子代雄性个体甲基化比例发生显著改变，成年肥胖等代谢问题的风险率显著升高[8]。据报道，不仅母体的叶酸或维生素B12水平在调节子代身体脂肪含量、分布、脂质代谢、胰岛素敏感性和DNA甲基化水平方面起着重要作用[7, 9]，而且父体叶酸缺乏同样能导致子代雄性小鼠DNA甲基化改变和生育能力降低[10]。虽然以上研究表明叶酸营养与动物脂肪代谢具有相关性，但叶酸调控脂肪代谢的途径目前还不清楚，叶酸调控肉鸡脂蛋白脂肪酶(liportein lipase, LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)基因表达和甲基化的机制尚未见报道。本试验以爱拔益加(AA)肉仔鸡为试验动物，探讨叶酸添加水平对肝脏脂肪代谢相关基因表达和甲基化的影响，为阐明叶酸调控家禽脂肪代谢的分子营养机制提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计选择1日龄AA肉仔鸡300只，随机分成3组，每组5个重复，每个重复20只鸡，试验鸡采用笼养，每笼10只。参照NRC(1994)营养需要配制玉米-豆粕型基础饲粮(表 1)，对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加5(试验1组)和10 mg/kg(试验2组)叶酸(纯度99%，购自Sigma公司)的试验饲粮。试验期为42 d，AA肉仔鸡分为2个生长阶段(1~21日龄和22~42日龄)饲养，建立严格的饲养管理制度，并做好详细的日常管理记录。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
分别于21和42日龄每个重复随机挑选体重和健康状况一致的6只鸡(公母各3只，每组30只)，空腹12 h，自由饮水，称重后翅下静脉采集血液3~5 mL，静置1 h后，以2 500 r/min离心20 min，分离血清，-20 ℃保存备用。于42日龄时每个重复随机挑选2只(公母各1只，每组10只)鸡屠宰，分离肝脏，用灭菌手术刀片把肝脏切割成0.5~1.0 g大小，分装在1.5 mL离心管中，液氮速冻。
1.3 血清中LPL和FAS含量及PPARγ活性的检测利用ELx800TM酶标仪(BioTek)，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法(ELISA试剂盒购自上海裕平生物科技有限公司)分别检测血清中LPL和FAS含量及PPARγ活性。
1.4 肝脏中LPL、PPARγ和FAS基因表达的测定采用TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取42日龄鸡肝脏组织总RNA。利用TIANSeq M-MLV反转录酶(Qiagen公司)合成cDNA第1链，保存在-20 ℃冰箱，备用。
根据LPL(注册号：NM_205282)、PPARγ(注册号：XM_414308)和FAS(注册号：NM_205155)基因的编码区，以β-肌动蛋白(β-actin)(注册号：L08165)为内参基因，利用Primer Primer 5.0设计特异性引物，引物序列见表 2。以上述cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析。按照宝日医生物技术(北京)有限公司SYBR® Advantage® qPCR Premix定量PCR试剂盒建议的反应体系，混合反应物，总体积为25 μL。利用Roche Light Cycler 480仪器进行扩增，程序为94 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，退火10 s，72 ℃ 1 s，循环40次。每个样本设3个重复，并设阴性对照。采用2-△△ct法计算目的基因的相对表达量。
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表 2 实时荧光定量PCR和甲基化PCR引物 Table 2 Primers of RT-qPCR and methylation PCR |
采用基因组提取试剂盒(Qiagen公司)提取42日龄鸡肝脏组织DNA，根据DNA浓度，将每个重复2只鸡的DNA混合成1个DNA池，每组5个DNA池。按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(Zymo Research Corp)说明书对上述DNA进行亚硫酸盐处理。
根据鸡LPL、PPARγ和FAS基因5′端上游序列特征，运用相关软件(Dragon promoter Finder、Promoter scan、TFSearch等)和网络资源寻找LPL、PPARγ和FAS基因的启动子区；利用在线软件MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设计LPL、PPARγ和FAS基因甲基化PCR引物(表 2)。运用巢式PCR分别进行PCR扩增。反应组成为：亚硫酸盐处理后的DNA(或第1轮PCR产物)1 μL，上、下游引物各1 μL (10 μmol/μL)，Premix Prime STAR HS (TaKaRa公司)12.5 μL，用灭菌双蒸水补充到25 μL。PCR反应程序：1)第1轮PCR[降落(touchdown)PCR]。94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s，退火温度(AT)+10 ℃ 40 s(每个循环降低1 ℃，退火温度见表 2，下同)，72 ℃ 40 s，10个循环；94 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。2)第2轮PCR。94 ℃ 3 min预变性；94 ℃ 30 s，退火温度40 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。收集第2轮PCR产物进行回收纯化，回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，每个DNA池选择5个阳性克隆进行测序，每组共测25个克隆。
1.6 数据统计与分析利用SAS 8.1软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较，同时应用回归方程进行线性回归分析，数据均采用平均值±标准误表示。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果与分析 2.1 叶酸添加水平对肉仔鸡血清中LPL、FAS活性和PPARγ含量的影响由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加10 mg/kg叶酸显著降低了21日龄肉仔鸡血清中LPL活性(P＜0.05)，饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸均极显著降低了42日龄肉仔鸡血清中LPL活性(P＜0.01)；饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸均极显著增加了21和42日龄肉仔鸡血清中PPARγ含量(P＜0.01)，且呈剂量效应关系(y=49x+247.33，R2=0.996 5，P=0.037 5)；饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸均极显著降低了21和42日龄肉仔鸡血清中FAS活性(P＜0.01)。
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表 3 叶酸添加水平对肉仔鸡血清中LPL、FAS活性和PPARγ含量的影响 Table 3 Effects of folate supplemental level on serum LPL, FAS activities and PPARγ content of broilers |
由表 4可知，肝脏中LPL和PPARγ基因的相对表达量在3组之间均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸均能显著降低肝脏中FAS基因的相对表达量(P＜0.05)，但添加5和10 mg/kg叶酸组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 4 叶酸添加水平对肉仔鸡肝脏中LPL、PPARγ和FAS基因表达的影响 Table 4 Effects of folate supplemental level on expression of LPL, PPARγ and FAS genes in liver of broilers |
在LPL基因上游存在1个CpG岛，根据甲基化引物设计的要求和LPL基因启动子的特点设计3条引物进行巢式PCR扩增，扩增区间为-612~-254(翻译起始位点ATG记为+1，下同)，产物大小为358 bp，包含42个CpG位点(图 1-A)。经克隆转化测序和统计分析，LPL基因启动子甲基化位点分布如图 1-B所示。从图 1-B可以看出，不论是对照组还是添加叶酸的试验组，42个CpG位点大多数处于非甲基化状态，只有个别CpG位点被甲基化；由表 5可知，LPL基因甲基化比率3组之间无显著差异(P>0.05)。
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A：CpG位点分布，数字代表距离翻译起始位点ATG上游的位置，黑色粗竖线代表每个CpG位点；B：甲基化测序结果，每行代表 1个克隆，●表示甲基化CpG位点，○表示未甲基化CpG位点。下图同。 A: distribution of CpG site, the number represented the distance from the translation initiation site of ATG, and the black thick line represented each CpG site; B: sequencing of methylation, each row represented one clone, the ● represented methylation CpG sites, and the ○ represented unmethylation CpG sites. The same as below. 图 1 LPL基因甲基化模式 Fig. 1 Methylation profile of LPL gene |
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表 5 叶酸添加水平对肉仔鸡肝脏中LPL、PPARγ和FAS基因甲基化的影响 Table 5 Effects of folate supplemental level on methylation of LPL, PPARγ and FAS genes in liver of broilers |
根据PPARγ基因5′上游序列特征，设计3条引物扩增PPARγ基因启动子部分片段，序列位于ATG位点上游-408~-49位置，大小为360 bp，含4个CpG位点(图 2-A)。PPARγ基因启动子甲基化位点分布如图 2-B所示。由表 5可知，对照组PPARγ基因甲基化比率为97.00%，添加5 mg/kg叶酸组PPARγ基因甲基化比率为95.00%，添加10 mg/kg叶酸组PPARγ基因甲基化比率为94.00%，3组之间均无显著差异(P>0.05)。
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图 2 PPARγ基因甲基化模式 Fig. 2 Methylation profile of PPARγ gene |
在FAS基因启动子-961~-749区域包含9个CpG位点，PCR扩增产物大小为213 bp(图 3-A)。FAS基因启动子甲基化位点分布如图 3-B所示。由表 5可知，对照组FAS基因甲基化比率为14.22%，添加5 mg/kg叶酸组FAS基因甲基化比率为44.44%，添加10 mg/kg叶酸组FAS基因甲基化比率为2.22%，其中添加5 mg/kg叶酸组FAS甲基化比率较对照组和添加10 mg/kg叶酸组极显著增加(P＜0.01)，对照组和添加10 mg/kg叶酸组之间差异不显著(P>0.05)。
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图 3 FAS基因甲基化模式 Fig. 3 Methylation profile of FAS gene |
叶酸作为一种重要的微量元素在畜牧养殖业的应用越来越广泛, 它主要在小肠内被吸收，通过门静脉进入肝脏。肝脏作为家禽重要的脂质代谢器官，其脂质代谢平衡受多种因子的调控[11]。其中，LPL、FAS和PPARγ是动物肝脏脂质代谢中重要的酶类或核转录调控因子[12-14]。本试验对不同叶酸添加水平对LPL、FAS活性和PPARγ含量的影响以及其基因表达情况和甲基化模式进行了探讨，研究结果可望为进一步研究叶酸在肝脏中的代谢途径奠定基础。
叶酸在动物肝脏中的代谢过程非常复杂，至少涉及30多种酶类[3]。LPL是一种催化脂肪组织中甘油三酯代谢的限速酶[15]，在富含甘油三酯的脂蛋白代谢中起着重要作用[16]，它通过水解富含甘油三酯的脂质颗粒参与能量平衡的控制[17]。最近研究表明，在怀孕大鼠饲粮中添加叶酸能显著降低仔鼠LPL基因和蛋白的表达、提高LPL基因启动子和第一外显子的甲基化水平[12]，与本研究中肉仔鸡饲粮中添加5 mg/kg叶酸组的结果基本一致。已有研究发现，与叶酸同为甲基供体的甜菜碱也能降低肉鸡肝脏中LPL基因的表达，同时引起LPL基因启动子区个别CpG位点处于超甲基化状态，但LPL基因整体甲基化水平并未受到显著影响[18]。因此，叶酸或甜菜碱下调LPL基因表达的原因是否归因于叶酸或甜菜碱改变了LPL基因的甲基化状态尚不确定。
PPARγ是一类由配体调节的核激素受体，属于核激素受体超家族[19]，它在脂肪细胞分化、脂肪酸转运、葡萄糖代谢和其他生理过程中起着关键作用，PPARγ基因高表达于白色和棕色脂肪组织[20]。在大鼠上的研究表明，PPARγ基因在肝脏和脂肪中的表达量依赖于母性怀孕期间饲粮中蛋白质和叶酸的水平，正常蛋白质水平下，母鼠饲粮中添加5 mg/kg叶酸上调了PPARγ基因在子鼠肝脏中的表达，却降低了PPARγ基因在子鼠脂肪中的表达[14]。另外，Sie等[21]证实母鼠饲粮补充叶酸可降低子代大鼠肝脏PPARγ基因启动子甲基化水平。对人脂肪间充质干细胞的研究结果表明，添加叶酸组PPARγ蛋白的表达量显著高于无叶酸组[22]。最近，对鸡前脂肪细胞的研究结果显示，随着叶酸水平的增加，PPARγ基因的相对表达量显著降低，但叶酸水平对PPARγ基因启动子甲基化却没有显著影响[23]。本研究结果显示，饲粮中添加叶酸增加了肉仔鸡血清中PPARγ的含量，但对PPARγ基因表达和甲基化基本没有影响，与上述研究存在差异，推测可能是因为所研究的物种或者用的试验组织不同造成的。
FAS是一种多功能的酶系统，催化来自乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的脂肪酸的形成，在脂质生物合成中起着中心作用[24]。对鸡肝细胞的研究表明，10、15和20 mg/kg的叶酸均能显著降低FAS基因的表达[25]；同样，在分化的鸡脂肪细胞中添加叶酸也能显著降低FAS基因的表达[23]。喻小琼[26]报道，种鸡饲粮添加5 mg/kg的叶酸能显著降低仔鸡1日龄肝脏FAS基因的表达；FAS基因启动子在鸡胚胎期处于高度去甲基化状态，不受日龄和叶酸添加水平的影响，FAS基因启动子甲基化程度与基因表达量并无相关性。本研究结果表明，饲粮中添加5 mg/kg叶酸显著降低了FAS基因在42日龄肉仔鸡肝脏中的表达，与上述研究结果一致；甲基化分析表明，饲粮中添加5 mg/kg叶酸增强了FAS基因在42日龄肉仔鸡肝脏中的甲基化水平，表明FAS基因的高甲基化抑制了FAS基因的表达。
4 结论① 饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸均极显著降低了42日龄肉仔鸡血清中LPL和FAS的活性，极显著提高了PPARγ的含量。
② 饲粮中添加5和10 mg/kg叶酸对42日龄肉仔鸡肝脏中LPL和PPARγ基因的表达未产生显著影响，但显著降低了FAS基因的表达。
③ 饲粮中添加5 mg/kg叶酸极显著提高了42日龄肉仔鸡肝脏中FAS基因的甲基化水平。
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