2. 安迪苏生命科学制品上海有限公司, 上海 201204
2. Adisseo Life Science(Shanghai) Co., Ltd., Shanghai 201204, China
坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)是家禽常见病，会影响家禽生长性能，造成严重的经济损失。据统计，在全球范围内，由NE造成的经济损失约20亿美元/年[1]。产气荚膜梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，是造成家禽NE的主要病原菌。目前，防治NE的主要措施是在饲粮中添加杆菌肽锌等抗生素，在饲粮中添加恩拉霉素可抑制肠道产气荚膜梭菌[2]。随着越来越多国家限制使用抗生素，家禽养殖业中若爆发NE，会给食品安全和动物福利带来更大的危害。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种绿色、无污染的好氧性益生菌，耐压、抗酸碱，通过胃酸后进入肠道，肠道内能以孢子形式迅速萌芽繁殖，消耗掉肠道内的氧，抑制有害菌，促进有益菌的增殖，改善饲料效率和肠道黏膜结构，对防治疾病、促进动物生长有积极作用。研究表明，健康的鸡胃肠道中产气荚膜梭菌数量较少，患NE鸡产气荚膜梭菌数量相对较多[3]，添加枯草芽孢杆菌可显著降低鸡群产气荚膜梭菌的感染程度[4]。本研究旨在研究枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能和肠道健康的影响，旨在为NE疾病的防治和抗生素的替代品研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料恩拉霉素购自先灵葆雅(上海)贸易有限公司，鸡球虫病四价活疫苗(柔嫩艾美尔球虫PTM株+毒害艾美尔球虫PNHZ株+巨型艾美耳球虫PMHY株+堆型艾美尔球虫PAHY株)由佛山市正典生物技术有限公司提供，每羽份含有1 100孢子囊。产气荚膜梭菌购自中国兽医微生物菌种保藏中心，菌种编号CVCC2017 type A，按照Forder等[5]试验中所提到的方法培养，细菌浓度为1×108 CFU/mL。枯草芽孢杆菌(B.subtilis DSM29784)由安迪苏(中国，上海)提供，含菌量为1×1010 CFU/g。
1.2 试验设计采用单因子随机分组设计，选用480只1日龄健康的肉公鸡(Ross 308)随机分为5组，分别为对照组(CON组)、产气荚膜梭菌攻毒组(CP组)、CP+10 mg/kg恩拉霉素组(ENRA组)，CP+10 mg/kg枯草芽孢杆菌(1010 CFU/g)组(BS组)和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢杆菌组(ENRA+BS组)，每组8个重复，每个重复12只鸡，试验期42 d，分2个阶段：第1~21天为前期，第22~42天为后期。在试验第14天，攻毒肉鸡灌喂10倍免疫剂量的混合型艾美尔球虫悬浮液[11 000孢子/(mL·只)]，对照组灌喂相同剂量的生理盐水；第16~18天，攻毒肉鸡每日灌喂产气荚膜梭菌悬浮液[108 CFU/(mL·只)]，连续灌喂3 d，对照组灌喂相同剂量的培养液。
1.3 试验饲粮试验饲粮为玉米-豆粕型基础饲粮，参照《鸡的饲养标准》 (NY/T 33—2004)并结合课题组前期研究结果配制[6], 其组成及营养水平见表 1。试验饲粮制成颗粒料形式饲喂。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
试验在四川农业大学动物营养研究所试验场进行。试验肉鸡均网上平养(高0.5 m×宽1.0 m×长1.0 m)，雏鸡前3天圈舍温度33 ℃，第4~7天逐渐降低至32~30 ℃，之后每周降低2 ℃，直到保持在22~24 ℃至试验结束。肉鸡采用连续光照、自然通风、自由采食和充足饮水，按正常免疫程序接种。
1.5 指标测定 1.5.1 生长性能试验期内观察试验鸡生长和健康状况，以重复为单位，记录耗料量，并于试验期第21、28和42天时，提前12 h断料，计算各组试验鸡的阶段体增重(BWG)、料重比(F/G)和阶段采食量(FI)。
1.5.2 肠道形态分别于试验期第21、28和42天时，每重复选取1只接近平均体重的肉鸡称重，颈静脉放血处死，分离空肠，取肠段中部约1.5 cm固定于10%的福尔马林溶液，将固定好的肠段用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察。测量肠段绒毛高度、隐窝深度，计算绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)。
1.5.3 肠道黏膜免疫球蛋白含量取肉鸡空肠中部靠前约5 cm长，刮取空肠黏膜，置液氮中保存，测定分泌型免疫球蛋白A(SlgA)和免疫球蛋白G(IgG)含量。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。
1.5.4 肠道损伤计分取肉鸡空肠中部靠后约7 cm的肠段，将肠段剪开，用生理盐水清洗干净，用滤纸将水吸干，肉眼观察肠道病变并计分。
计分标准：0=无肉眼可见的损伤；1=肠壁薄或易碎(充血)；2=小的局灶坏死或溃疡(1~5灶)；3=局灶性坏死或溃疡。
1.5.5 肠道微生物数量分离盲肠，收集盲肠食糜，置液氮中保存，测定肠道微生物，包括总菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌数量。提取DNA试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用RT-PCR Taqman探针法测定盲肠微生物数量。参照钟丽梅等[6]方法测定，试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。结果用每克内容物中细菌数量的常用对数表示[lg(拷贝数/g)]。
1.6 数据统计数据经Excel 2013整理，SPSS 19.0软件分析，采用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较。试验结果以“平均值±标准差”表示，P < 0.05为显著差异，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能的影响从表 2可以看出，第1~21天，各组间体重、体增重和采食量没有显著差异(P > 0.05)，产气荚膜梭菌攻毒后，各组F/G有升高趋势(P=0.051)，CP组F/G在数值上高于其他各组(P > 0.05)。第22~28天和第29~42天，各组间生长性能差异均不显著(P > 0.05)，从数值上来看，ENRA组、BS组和ENRA+BS组的F/G较CP组有所降低，但差异不显著(P > 0.05)。全期，各组间体增重和采食量均没有显著差异(P > 0.05)，ENRA组和ENRA+BS组的F/G显著低于CP组(P < 0.05)。
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表 2 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of Bacillus subtilis on growth performance of broilers challenged by Clostridium perfringens |
从表 3可以看出，第21天，CP组计分最高，CON组最低，ENRA组、BS组和ENRA+BS组的计分低于CP组。第28天，CP组的计分最高，极显著高于其余各组(P < 0.01)。第42天，各组计分没有显著差异(P > 0.05)。
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表 3 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡空肠病变计分的影响 Table 3 Effects of Bacillus subtilis on score of jejunal lesions of broilers challenged by Clostridium perfringens |
从表 4可以看出，第21天和第42天时，ENRA组隐窝深度极显著低于CP组、BS组和ENRA+BS组(P＜0.01)。第42天时，与CP组相比，ENRA组VH/CD显著增加(P＜0.05)，BS组和ENRA+BS组VH/CD有提高趋势(P > 0.05)。第28天时，组间各项指标没有显著差异(P＞0.05)。
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表 4 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡空肠形态的影响 Table 4 Effects of Bacillus subtilis on jejunal morphology of broilers challenged by Clostridium perfringens |
从表 5可以看出，第21天时，与CP组相比，ENRA+BS组SIgA含量显著增加(P < 0.05)；第28天时，与CP组相比，BS组和ENRA+BS组IgG含量显著增加(P < 0.05)；第42天时，各组IgG和SIgA含量差异均不显著(P > 0.05)。
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表 5 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡空肠黏膜IgG和SIgA含量的影响 Table 5 Effects of Bacillus subtilis on IgG and SIgA contents in jejunal mucosa of broilers challenged by Clostridium perfringens |
从表 6可以看出，与CP组相比，ENRA组、BS组和ENRA+BS组第21天大肠杆菌数量极显著降低(P < 0.01)，ENRA组乳酸杆菌数量显著增加(P < 0.05)，BS组和ENRA+BS组乳酸杆菌数量有所增加(P > 0.05)，ENRA组、BS组和ENRA+BS组第28天产气荚膜梭菌数量极显著降低(P < 0.01)。各组间总菌数量差异不显著(P > 0.05)。
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表 6 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡盲肠微生物数量的影响 Table 6 Effects of Bacillus subtilis on the number of cecal microbes of broilers challenged by Clostridium perfringens |
临床上NE会引起肉鸡严重的肠道损伤和死亡，而亚临床症状会降低屠宰时肉鸡的体重、采食量和饲料转化效率[7]。本试验表明，产气荚膜梭菌攻毒后，肉鸡第1~21天F/G有增加趋势，与李慧贤等[8]的研究结果一致，该研究表明产气荚膜梭菌感染肉鸡会导致早期饲料转化效率在数值上的下降。同时本试验发现添加枯草芽孢杆菌后，各生长性能指标均有所提高。关于枯草芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响研究大多在正常条件下进行，饲粮中添加枯草芽孢杆菌对肉鸡前期的生长性能没有显著影响[9]；饲粮中添加枯草芽孢杆菌肉鸡全期生长性能与攻毒组无显著差异[10]；芽孢杆菌对鸡平均日增重的影响存在时间上的积累性，而非速效性[11]。在产气荚膜梭菌攻毒条件下的研究较少，宫秀燕等[12]研究表明，在产气荚膜梭菌感染后，饲粮中添加凝结芽孢杆菌有增加肉鸡体重的趋势。本试验结果表明，产气荚膜梭菌攻毒后，恩拉霉素和枯草芽孢杆菌混合使用显著降低肉鸡第1~42天F/G，添加枯草芽孢杆菌对肉鸡第1~42天F/G有一定的改善作用，而对肉鸡前期生长性能没有显著影响。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌和恩拉霉素混合使用可改善产气荚膜梭菌攻毒后肉鸡的生长性能。
3.2 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡空肠形态和病变的影响肠道形态包括绒毛高度、隐窝深度和VH/CD。小肠绒毛是肉鸡消化和吸收营养物质的特有结构，绒毛高度、隐窝深度直接影响小肠的吸收面积[13]，绒毛高度增高，吸收养分成熟细胞就会增多，吸收养分的能力就越强。隐窝深度反映了细胞生成率，隐窝变浅说明细胞成熟率上升，分泌功能增强[14-15]。VH/CD综合反映小肠绒毛吸收功能，VH/CD增大，说明绒毛对营养物质的吸收能力增强，VH/CD减小时则减弱。产气荚膜梭菌攻毒后，患有NE肉鸡的空肠绒毛高度和VH/CD相比健康肉鸡低[16]。本试验发现，产气荚膜梭菌攻毒后的肉鸡空肠黏膜绒毛高度和VH/CD在数值上都有所下降，但差异不显著。饲粮中添加枯草芽孢杆菌能显著降低空肠隐窝深度, 提高VH/CD[17]。临武鸭饲粮中添加5.0×1010 CFU/kg枯草芽孢杆菌，对空肠VH/CD有显著影响[18]。枯草芽孢杆菌PB6可改善产气荚膜梭菌攻毒后肉鸡的肠道形态[19]。本试验结果表明，产气荚膜梭菌攻毒后，枯草芽孢杆菌对肉鸡肠道形态没有显著影响, 在数值上略微提高了肉鸡第21天和第42天空肠绒毛高度和VH/CD。这说明枯草芽孢杆菌在本试验中对攻毒后的肉鸡肠道形态上有一定的作用，但效果不明显，与前人研究结果不完全一致。这可能与枯草芽孢杆菌的添加量、饲养环境、产气荚膜梭菌攻毒效果等因素有关。
肉鸡NE严重程度主要根据病变评分或死亡率量化[20-21]。本试验表明，产气荚膜梭菌攻毒显著增加了第28天空肠病变计分，与Wu等[16]的报道一致。添加芽孢杆菌对肠道损伤有明显的改善效果。Jayaraman等[19]研究表明，肉仔鸡在产气荚膜梭菌攻毒后添加枯草芽孢杆菌，第28天的肠道损伤计分显著低于攻毒组。宫秀燕等[12]研究表明，凝结芽孢杆菌能降低肠道病变计分。本试验结果显示，第28天时，产气荚膜梭菌攻毒后，添加枯草芽孢杆菌及恩拉霉素和枯草芽孢杆菌混合使用显著降低了肉鸡空肠损伤计分，与前人报道结果一致。这说明枯草芽孢杆菌可以降低肠道病变计分，防止肉鸡患NE，提高肠道健康。
3.3 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡空肠黏膜IgG和SIgA含量的影响肠道黏膜中IgG和SIgA可加强肠道细胞吞噬作用，SIgA是胃肠道和黏膜表面主要免疫球蛋白，是防御病菌在肠道黏膜黏附和定植的第1道防线[22-23]。益生菌可在肠道黏附定植，发挥特异性免疫作用活化相关淋巴组织，使SIgA生物合成增加，提高黏膜免疫功能[24]。Vinderola等[25]用瑞士乳杆菌灌喂小白鼠，小肠中SIgA浆细胞数量有所增加，提示益生菌能增强黏膜免疫功能。王丽凤[26]研究表明，饮水喂给益生菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P-8)可显著提高14及42日龄肉鸡肠液中SIgA含量。唐志刚等[27]研究表明，在不同营养水平饲粮中添加益生菌，能提高21和42日龄肉鸡肠道黏膜中IgG和42日龄黏膜中SIgA含量。本试验结果表明，产荚膜梭菌攻毒后，ENRA+BS组显著增加第21天空肠黏膜SIgA含量，BS组和ENRA+BS组显著增加第28天IgG含量，说明枯草芽孢杆菌在产气荚膜梭菌攻毒后能提高肠道免疫功能。
3.4 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡盲肠微生物数量的影响动物胃肠道内微生物区系的平衡主要由有益菌(乳酸杆菌、双歧杆菌)维持，如果胃肠道有害菌(大肠杆菌、沙门氏菌)繁殖过度，造成微生物区系紊乱，可能造成动物肠道疾病。据报道，芽孢杆菌可以使胃肠道内有益菌的数量增加，这些细菌会产生大量乳酸降低肠道内pH，从而抑制有害菌的增殖。Jayaraman等[19]研究表明，产气荚膜梭菌攻毒后，攻毒组显著增加第28天产气荚膜梭菌的数量。本试验结果与前人研究一致。易中华等[28]研究表明，枯草芽孢杆菌能减少肉鸡盲肠中的总需氧菌、大肠杆菌和沙门氏菌数量，增加乳酸杆菌数量。Li等[29]研究表明，枯草芽孢杆菌降低盲肠中产气荚膜梭菌和大肠杆菌数量。La Ragione等[30]研究报道，枯草芽孢杆菌能减少肉鸡经口服低剂量产气荚膜梭菌后肠道产气荚膜梭菌数量。本试验结果表明，产气荚膜梭菌攻毒后，枯草芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌和恩拉霉素混合使用均能降低第21天盲肠大肠杆菌数量和第28天产气荚膜梭菌数量，与前人研究结果一致。这说明枯草芽孢杆菌可以抑制肠道有害菌的增殖，保护肠道健康。
4 结论枯草芽孢杆菌及恩拉霉素和枯草芽孢杆菌混合使用可降低产气荚膜梭菌感染肉鸡的肠道病变计分，促进小肠绒毛的生长发育，提高肠道免疫功能，促进有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖，从而改善肉鸡的生长性能。
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