2. 国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室, 青岛 266109
2. National Waterfowl Industrial Technology System Nutrition and Feed Function Laboratory, Qingdao 266109, China
铜参与机体许多重要调节过程，是众多抗氧化酶的组成成分，在免疫过程中发挥着重要作用[1-2]。动物铜摄入量过多或过少均可导致体内器官的生化紊乱、生理功能障碍及多种病理变化。动物铜缺乏症的原因一般包括如下2种：一是原发性缺铜，即长期铜摄入量不足；二是继发性缺铜，即铜摄入量足够，但动物对铜的吸收受到干扰，例如饲粮中植酸盐含量过高或维生素C摄食量过多，干扰铜的吸收利用，造成铜吸收不足和排泄过多，引起铜缺乏症。此外，养殖者为达到畜禽高速生长的目的，在饲粮中添加高剂量的铜，导致产品金属沉积量增多，铜利用率低，并且过量的铜排放到环境中，造成环境污染。因此，开发出新型高效生物铜制剂，对提高动物铜吸收利用率和减少金属排放都具有重要意义。
饲粮中添加适宜水平的铜能够促进动物的生长，提高饲料利用率[3]。Kumar等[4]研究表明，高剂量的铜能够导致大鼠肝脏、肾脏、大脑结构损伤，肝脏结构损伤尤为严重。王聪等[5]研究表明，以蛋氨酸铜作为铜源可降低西门塔尔牛体内的过氧化程度，减少脂质过氧化物对机体的损害。Huang等[6]发现，饲粮中添加有机铜能够有效降低铜的排放率。益生菌能够富集锌离子(Zn2+)，能够完成无机锌向有机锌的转化，提高锌的生物学效价[7]。目前，对有机铜和枯草芽孢杆菌促进畜禽生长发育技术研究和产品开发较多，而枯草芽孢杆菌铜的制备和其对先天性缺铜大鼠生长发育、血清生化指标及抗氧化能力影响的研究未见报道，其产品还处于空白。因此，本试验通过开展枯草芽孢杆菌铜干预先天性缺铜大鼠试验研究，旨在探索枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠生长发育、器官指数、铜沉积量、血清生化和抗氧化指标的影响，为制备的枯草芽孢杆菌铜产品性能提供科学评价，同时也为动物铜减量化使用提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器枯草芽孢杆菌由本实验室驯化选育，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏(保藏号：15329)；采用本菌制备的枯草芽孢杆菌铜，枯草芽孢杆菌活菌数达1.5×109 CFU/g，铜含量为2 906.34 mg/kg。五水硫酸铜(有效成分含量为98.5%)，分析纯，购自浙江新维普添加剂有限公司。
试验主要仪器：电子分析天平、恒温水浴锅、磁力搅拌器、组织均浆器、紫外分光光度计等。
1.2 试验饲粮基础饲粮购于南通特洛菲有限公司，按照AIN-93标准[8]生产，经检测基础饲粮中铜含量为0.33 mg/kg，为缺铜饲粮；正常饲粮是在缺铜饲粮基础上添加6.0 mg/kg五水硫酸铜，使饲粮铜含量达到6.33 mg/kg。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验分为2个阶段，第1阶段：先天性缺铜幼龄大鼠模型建立；第2阶段：先天性缺铜大鼠后天干预试验。
1.3.1 先天性缺铜幼龄大鼠模型建立选取怀孕10 d的SD大鼠72只，平均分为模型组和对照组，每组6个重复，每个重复6只。模型组大鼠孕期饲喂缺铜饲粮(铜含量为0.33 mg/kg)，对照组大鼠孕期饲喂正常饲粮(在缺铜饲粮基础上添加6.0 mg/kg五水硫酸铜)，持续到哺乳期结束。
造模结束后，模型组和对照组各抽取12只幼龄大鼠，禁食12 h，取血清和肝脏样品，并检测生长指标、肝脏铜含量及血清生化指标，验证模型是否建立成功。
1.3.2 先天性缺铜大鼠后天干预试验选择建模成功的24日龄先天性缺铜幼龄大鼠108只，随机分成6个组，Ⅰ~Ⅲ组为硫酸铜组，Ⅳ~Ⅵ组为枯草芽孢杆菌铜组，分别添加不同水平硫酸铜和枯草芽孢杆菌铜，每组3个重复，每个重复6只，所有大鼠均饲喂缺铜饲粮，试验期35 d。干预期大鼠分组饲喂情况如表 2所示。
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表 2 干预期大鼠分组饲喂情况 Table 2 Group feeding situation during trial intervention |
试验期间，大鼠自由摄食、饮水(去离子水)，室内温度为(22±2) ℃，相对湿度为(55±5)%，室内通风良好。每天观察大鼠的精神状态，记录摄食量和饮水量，并且每周称量1次体重。
1.5 动物屠宰方式及取样饲养35 d后，对大鼠禁食24 h后，测量体重、体长。每组分别抽取12只仔鼠进行取样分析。采取眼球取血，3 000 r/min离心10 min，取血清-80 ℃保存。脊椎脱臼法处死大鼠后，迅速测量体长并分离心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、大脑等器官，置于冷生理盐水中洗净后用滤纸吸干其表面液体进行称重，计算器官指数。
1.6 测定指标及方法 1.6.1 血清生化指标测定血清中谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)的活性采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。
1.6.2 血清抗氧化指标测定血清中铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn superoxide dismutase，CuZn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)活性和丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。
1.6.3 铜沉积量测定将恒重的组织器官用湿法消化法消化处理，过滤定容。具体方法如下：准确称取样品于三角烧瓶中，加入10 mL硝酸、2 mL高氯酸，隔夜消解，并做对照。之后在180 ℃左右将样品消化至透明，加入少量的去离子水，在水中加热蒸发至2 mL左右，然后转移至25 mL的容量瓶中，用去离子水定容，用0.22 μm水系膜过滤后上机检测。
1.7 统计分析试验所得数据以重复为单位进行数据处理，利用SPSS 17.0软件中GLM模型分析主效应和互作效应，用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法对数据进行差异显著性分析，模型组和对照组组间差异采用t检验分析。P < 0.05和P < 0.01分别表示显著和极显著差异。
2 结果与分析 2.1 幼龄大鼠缺铜模型的建立由表 3可知，经过缺铜饲粮干预后，模型组的体重、体长显著低于对照组(P < 0.05)，模型组的肝脏铜含量及CP、AKP和CuZn-SOD活性显著低于对照组(P < 0.05)。结果表明，先天性缺铜幼龄大鼠缺锌模型建立成功。
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表 3 低铜饲粮对幼龄大鼠生长指标、肝脏铜含量及血清生化指标的影响 Table 3 Effects of low-copper diet on growth indices, liver copper content and serum biochemical parameters of young rats |
由表 4可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的体重、体长、体重/体长影响不显著(P＞0.05)。铜源能够显著影响大鼠的体重(P＜0.05)，在铜添加量相同条件下，枯草芽孢杆菌铜组体重、体长均高于硫酸铜组，并且Ⅳ组体重显著高于Ⅰ组(P＜0.05)。铜添加量能够极显著影响大鼠的体重、体长(P＜0.01)，体重和体长均随着铜添加量的增加呈上升趋势，Ⅱ、Ⅲ组体重、体长分别显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，Ⅵ组体重、体长显著高于Ⅳ组(P＜0.05)。
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表 4 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠生长发育的影响 Table 4 Effects of Bacillus subtilis copper on growth and development of congenital copper deficiency rats |
结果表明，适量枯草芽孢杆菌铜和硫酸铜对先天性缺铜大鼠生长发育具有促进作用。枯草芽孢杆菌组对先天性缺铜大鼠生长发育的修复效果优于硫酸铜。
2.3 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官指数的影响由表 5可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数、肺脏指数影响不显著(P＞0.05)。铜源和铜添加量对大鼠的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数、肺指数影响不显著(P＞0.05)。
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表 5 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官指数的影响 Table 5 Effects of Bacillus subtilis copper on organ indexes of congenital copper deficiency rats |
以上结果表明，枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官指数的修复不随铜添加量的增加而提高。
2.4 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清生化指标的影响由表 6可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的血清AKP活性影响极显著(P＜0.01)。铜源能够极显著影响大鼠的血清CP、AKP活性(P＜0.01)，在铜添加量相同条件下，Ⅴ组血清CP活性显著高于Ⅱ组(P＜0.05)，Ⅴ、Ⅵ组血清AKP活性分别极显著高于Ⅱ、Ⅲ组(P＜0.01)。铜添加量能够极显著影响大鼠的血清CP、AKP活性(P＜0.01)，随着铜添加量的增加，大鼠血清CP、AKP活性呈上升趋势，Ⅲ组血清CP活性极显著高于Ⅰ组(P＜0.01)，显著高于Ⅱ组(P＜0.05)；Ⅵ组血清CP活性显著高于Ⅴ组(P＜0.05)，极显著高于Ⅳ组(P＜0.01)；Ⅵ组血清AKP活性显著高于Ⅴ组(P＜0.05)，极显著高于Ⅳ组(P＜0.01)；Ⅲ组血清AKP活性显著高于Ⅱ组(P＜0.05)。
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表 6 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清CP和AKP活性的影响 Table 6 Effects of Bacillus subtilis copper on activities of CP and AKP in serum of congenital copper deficiency rats |
以上结果表明，先天性缺铜大鼠血清CP、AKP活性随铜添加量的增加而提高，在铜添加量相同条件下，枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更有利于提高先天性缺铜大鼠血清CP和AKP活性。
由表 7可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的血清AST、ALT活性及AST/ALT影响不显著(P＞0.05)。铜源能够显著影响大鼠的血清AST/ALT(P＜0.05)，极显著影响血清AST活性(P＜0.01)，在铜添加量相同条件下，Ⅳ组血清ALT活性显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，Ⅳ组血清AST/ALT显著低于Ⅰ组(P＜0.05)。铜添加量对大鼠血清AST活性影响极显著(P＜0.01)，Ⅲ组血清AST活性极显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，Ⅵ组血清AST活性显著高于Ⅳ组(P＜0.05)。
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表 7 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清AST和ALT活性的影响 Table 7 Effects of Bacillus subtilis copper on activities of AST and ALT in serum of congenital copper deficiency rats |
以上结果表明，当铜添加量相同时，枯草芽孢杆菌铜组血清AST和ALT活性比硫酸铜组有增长趋势，枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更有利于提高先天性缺铜大鼠机体抗应激能力。
2.5 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清抗氧化指标的影响由表 8可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的血清GSH-Px、CuZn-SOD活性及MDA含量影响不显著(P＞0.05)。铜源能够显著影响大鼠的血清GSH-Px活性(P＜0.05)，极显著影响血清CuZn-SOD活性和MDA含量(P＜0.01)，在铜添加量相同条件下，Ⅳ组血清GSH-Px活性显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，Ⅱ组血清MDA含量显著高于Ⅴ组(P＜0.05)。铜添加量能够极显著影响大鼠的血清GSH-Px、CuZn-SOD活性及MDA含量(P＜0.01)，Ⅲ组血清GSH-Px活性极显著高于Ⅰ组(P＜0.01)，Ⅵ组血清GSH-Px活性显著高于Ⅳ组(P＜0.05)；Ⅲ组血清CuZn-SOD活性显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，Ⅵ组血清CuZn-SOD活性极显著高于Ⅳ组(P＜0.01)；Ⅲ组血清MDA含量极显著低于Ⅰ组(P＜0.01)。
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表 8 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清抗氧化指标的影响 Table 8 Effects of Bacillus subtilis copper on serum antioxidant indices of congenital copper deficiency rats |
以上结果表明，血清GSH-Px和CuZn-SOD活性随铜添加量增加而提高，在铜添加量相同条件下，枯草芽孢杆菌铜组血清GSH-Px和CuZn-SOD活性均比硫酸铜组有增长趋势，血清MDA含量有降低趋势。枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更有利于提高先天性缺铜大鼠机体抗氧化能力。
2.6 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官铜沉积量的影响由表 8可知，铜源与铜添加量的交互作用对大鼠的心脏、肝脏、肾脏中铜沉积量影响不显著(P＞0.05)。铜源能够显著影响大鼠的肝脏、肾脏中铜沉积量(P＜0.05)，在铜添加量相同条件下，枯草芽孢杆菌铜组心脏、肝脏、肾脏中铜沉积量均比硫酸铜组有所增加，其中Ⅵ组肾脏中铜沉积量显著高于Ⅲ组(P＜0.05)。铜添加量能够显著影响大鼠的心脏中铜沉积量(P＜0.05)，极显著影响肝脏、肾脏中铜沉积量(P＜0.01)；其中Ⅵ组心脏、肝脏、肾脏中铜沉积量显著高于Ⅳ组(P＜0.05)，Ⅲ组肾脏中铜沉积量显著高于Ⅰ组(P＜0.05)。
以上结果表明，添加一定量的铜能够改变先天性缺铜大鼠的心脏、肝脏、肾脏中铜沉积量，铜沉积量与铜添加量呈正比；另外枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更利于在肝脏、肾脏中铜的积累。
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表 9 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官铜沉积量的影响 Table 9 Effects of Bacillus subtilis copper on organ copper deposition of congenital copper deficiency rats |
吕咸坤[9]研究发现，患铜缺乏症的家畜表现食欲减退或消失、下痢、贫血、被毛脱色、生长发育缓慢等症状。Ergaz等[10]研究表明，在饮食诱导大鼠胎儿生长限制模型中，缺铜能够降低胎儿生长和抗氧化能力。Dziezyc等[11]研究表明，过度使用抗铜剂可能导致缺铜，并导致神经和血液学症状。本试验模型组大鼠出现了被毛粗糙、生长发育缓慢、幼龄大鼠存活率低等缺铜症状，通过测定发现模型组体重、体长及血清CP、AKP、CuZn-SOD活性比对照组显著降低，表明幼龄大鼠先天性缺铜模型建立成功，为后期探究枯草芽孢杆菌铜的生物性能奠定了基础。
3.2 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠生长发育的影响饲粮中添加铜形式、铜水平、动物种类、生长阶段等报道不尽相同。胥彩玉等[12]以添加有机铜和无机盐铜饲粮饲喂1~6周龄肉仔鸡，结果表明，铜添加形式对肉仔鸡平均日增重无显著影响。赵春雨等[13]研究表明，在猪平均日采食量基本相同时，氨基酸铜组平均日增重比硫酸铜组高1.52%~1.79%。另外，适宜剂量的铜对动物生长具有显著促进作用[14-15]。本试验结果表明，适量枯草芽孢杆菌铜和硫酸铜对先天性缺铜大鼠生长发育具有促进作用，就添加的铜源而言，枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更有利于大鼠生长发育。
3.3 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官指数的影响铜可刺激动物免疫器官的发育。田香迪等[16]研究表明，在肉仔鸡饲粮中添加8 mg/kg纳米氧化铜和纳米铜能显著降低胰脏指数、胃指数，对肝脏指数、心脏指数无显著影响。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官指数影响不显著。
3.4 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清生化指标的影响微量元素铜既参与动物体内的造血，又是多种酶的组成成分，对AKP和CP的干预作用尤为显著。CP是血液中含量最丰富的含铜蛋白，是一种具有抗氧化性、能强有力抑制脂类自身氧化、清除体内自由基的蛋白质。郑鑫等[17]研究表明，在建立的猪原代肝细胞培养模型中添加铜能够影响CP的活性，且与铜浓度相关，另外CP对于低浓度的铜反应不明显，随铜浓度的增加其活性亦升高；铜浓度过高，CP活性受抑制而呈降低趋势。赵春雨等[18]研究表明，在饲粮中添加300 mg/kg不同来源的铜(硫酸铜、蛋氨酸铜)可显著提高血清CP活性。钱剑等[19]研究表明，在培养液中添加一定浓度的铜能促进软骨细胞产生AKP，并在培养的8 d内持续增加。本试验研究表明，血清CP和AKP活性随铜添加量的增加而提高，与上述结果基本一致。另外，枯草芽孢杆菌铜和硫酸铜均有提高先天性缺铜大鼠血清CP和AKP活性的作用，且前者修复效果优于后者，表明枯草芽孢杆菌铜是一个良好的补铜添加剂。
Boal等[20]研究表明，铜能与多种酶的辅基相结合或链接在铜转运、伴侣蛋白上。铜在体内需要维持平衡，铜代谢异常可造成肝脏损伤等多种疾病。在氨基酸代谢和蛋白质、脂肪及糖三者的转换过程中，转氨酶占有极其重要的地位，尤其是AST、ALT的活性还是反映肝脏功能是否正常的重要指标[21]；在正常情况下，AST和ALT的活性是相对稳定的，大量医学试验表明，AST和ALT是反映肝细胞损伤程度的灵敏指标之一，血清中微量的转氨酶活性即可表征肝功能是否受到损伤[22]。谭志刚等[23]将氯化铜溶解在生理盐水中对小鼠进行腹腔注射，结果发现血清AST、ALT活性显著升高。李万立等[24]用硫酸铜对昆明小鼠进行灌胃，发现血清ALT、AST活性显著升高。本试验研究表明，枯草芽孢杆菌比硫酸铜更有利于提高先天性缺铜大鼠血清AST、ALT活性，从而增强先天性缺铜大鼠机体抗应激能力。
3.5 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠血清抗氧化指标的影响王聪等[5]研究表明，以蛋氨酸铜作为铜源可降低西门塔尔牛体内的过氧化程度，减少脂质过氧化物对机体的损害。冯杰等[25]研究表明，超氧化物歧化酶(SOD)有利于提高氧的利用率。GSH-Px的主要作用是清除脂质过氧化物和过氧化氢(H2O2)，减轻细胞膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用，减少自由基的产生。MDA是生物体内自由基指示物[26]，赵春雨等[18]研究表明，饲粮添加150 mg/kg铜能够显著提高猪血清GSH-Px和CuZn-SOD活性。本试验研究表明，铜添加量能够影响先天性缺铜大鼠机体抗氧化能力，并且随着铜添加量的增加抗氧化能力增强。枯草芽孢杆菌比硫酸铜更有利于提高先天性缺铜大鼠机体抗氧化能力。
3.6 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠器官铜沉积量的影响铜是动物生长发育必需的微量元素，在各组织器官中，以肝脏中铜沉积量最高，但过量铜蓄积会导致人体肝脏严重受损[27-28]。铜源及铜添加量都能显著影响大鼠血浆中铜含量[29]。Ozkul等[30]通过添加15 mg/kg硫酸铜、鞣酸铜饲喂大鼠28 d后，发现添加铜组比不添加铜组血浆中铜含量显著提高。Engle等[31]饲喂鹿不添加铜的基础饲粮(铜含量为10.2 mg/kg)和添加20、40 mg/kg铜的基础饲粮155 d，结果发现3组鹿肝脏中铜含量分别为63、290和380 mg/kg。饲粮中添加纳米氧化铜能显著提高肉鸡血清和组织中铜含量[32]。本试验结果表明，添加适量的铜能够改变心脏、肝脏、肾脏中铜沉积量，其铜沉积量与铜添加量呈正相关；枯草芽孢杆菌铜比硫酸铜更利于肝脏、肾脏中铜的积累。
4 结论① 枯草芽孢杆菌铜和硫酸铜对先天性缺铜大鼠生长发育，血清CP、AKP、AST活性，肝脏、肾脏中铜沉积量，机体抗氧化能力等指标均有促进作用，且随铜添加量的增加而提高。
② 枯草芽孢杆菌铜对先天性缺铜大鼠后天干预修复效果优于硫酸铜。
③ 饲粮中使用枯草芽孢杆菌铜可以降低铜添加量。
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