2. 中国农业科学院饲料研究所, 奶牛营养学北京市重点实验室, 农业部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081;
3. 北京市畜牧总站, 北京 100107
2. Key Laboratory of Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture, Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
3. Beijing Municipal Animal Husbandry Station, Beijing 100107, China
全株青贮玉米具有较高的生物学产量和良好的饲料转化效率,是反刍动物重要的粗饲料来源。全株玉米在青贮制作前,采用干物质(DM)和淀粉(Starch)含量作为奶牛场收购的定价指标,从而达到按质论价,确保青贮饲料营养质量,以提高养殖场的经济效益。全株青贮玉米资源的综合利用,首先要准确评估其原料营养价值,而该方面研究主要集中于概略养分分析。目前,康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS)是我国在评定反刍动物粗饲料营养价值时常用的一种方法[1-2],其对粗饲料纤维和蛋白质成分的分析更加全面。近年来,近红外光谱(NIRS)分析技术在反刍动物饲料营养成分检测中应用广泛[3],其较传统化学分析技术能够更加快速、准确地预测饲料中的营养成分。因此,本试验采用CNCPS方法分析了北京市18个牧场89份全株玉米原料的营养组分,为全株玉米原料在实际生产中的应用提供基础数据;利用NIRS分析技术对全株玉米原料中的营养组分分别建立定标模型,并对其进行相应的外部验证,确定全株玉米原料营养价值模型预测的可行性,为生产中快速评估全株玉米原料的营养价值提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集和制备本试验共采集全株玉米原料样品89份,来自北京市延庆区、昌平区、密云区、大兴区、房山区、丰台区和顺义区等地的18个牧场。2017年8—10月,在奶牛场各自青贮制备前,选取具有代表性的无发霉、无杂草的经切短的全株玉米原料样品3~4 kg,同时制作样品采集信息记录卡(记录内容包括样品名称、品种名称、采集时间、籽实收获时间、采集地点、采样人等),随样品装入采样袋。采集的全株玉米原料样品符合《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)的要求。
将采集回实验室的全株玉米原料样品用PSS-HA-03 NIRS分析仪(Polytec Gmb H)扫描,采集光谱,称重,65 ℃烘箱烘干48 h,回潮24 h,制成风干样品,以粉碎机(Retsch SM-100)粉碎样品,过40目饲料分析筛后将样品混合均匀,装入自封袋保存备用。
1.2 全株玉米原料营养组分分析 1.2.1 概略养分分析DM、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)的含量按照AOAC(1995)[4]方法进行测定;中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)、中性洗涤不溶蛋白质(NDIP)、酸性洗涤不溶蛋白质(ADIP)的含量按照Sniffen等[5]的方法测定;可溶性蛋白质(SP)的含量按照Krishnamoorthy等[6]的方法测定;Starch含量通过Megazyme淀粉试剂盒进行测定。每个样本做3个重复。
1.2.2 CNCPS对营养组分的划分及计算方法CNCPS 6.5为2015年最新的CNCPS版本。将碳水化合物(CHO)分为3部分:快速降解碳水化合物(CA)、中速降解碳水化合物(CB)和不可降解碳水化合物(CC)[7]。其中,CA包括挥发性脂肪酸(CA1)、乳酸(CA2)、其他有机酸(CA3)和水溶性碳水化合物(CA4),CB包括淀粉(CB1)、可溶性纤维(CB2)和可消化纤维(CB3)。CA、CB1和CB2为非纤维性碳水化合物(NFC),CC是ADL的2.4倍,CB3和CC为纤维性碳水化合物(FC),计算公式如下:
CHO(%DM)=100-CP(%DM)-EE(%DM)-Ash(%DM);
NFC(%DM)=CHO(%DM)-NDF(%DM);
CB2(%DM)=NFC(%DM)-CA1(%DM)-CA2(%DM)-CA3(%DM)-CA4(%DM)-CB1(%DM);
CB3(%DM)=NDF(%DM)-CC(%DM);
CC(%DM)={NDF(%DM)×[ADL(%DM)× NDF(%DM)×2.4]}/100。
将蛋白质分为非蛋白氮(NPN,PA)、真蛋白质(PB)和非降解蛋白质(PC)3部分。PA又被进一步的分为氨(PA1)和可溶性真蛋白质(PA2),PB分为难溶性真蛋白质(PB1)、纤维结合蛋白质(PB2),计算公式如下:
PA1(%DM)=氨含量(%SP)×[SP(%CP)/100]×[CP(%DM)]/100;
PA2(%DM)=[SP(%CP)×CP(%DM)]/100-PA1(%DM);
PB1(%DM)=CP(%DM)-PA1(%DM)-PA2(%DM)-PB2(%DM)-PC(%DM);
PB2=[NDIP(%CP)-ADIP(%CP)]×CP(%DM)/100;
PC=ADIP(%CP)×CP(%DM)/100。
1.3 NIRS模型的建立 1.3.1 NIRS仪器设备及处理软件采用的仪器为PSS-HA-03 NIRS分析仪(Polytec,德国),该仪器采集试验样品的数据采集积分时间是25 ms,单个样品检测时间为2.5 s,光谱分辨率为2 nm,波长为850~1 650 nm。保证样品杯中样品平整且厚度一致,利用扫描软件PSS-AXC采集数据。
1.3.2 NIRS分析方法全株玉米原料样品经偏最小二乘法回归(partial least squares regression, PLSR)后。通过SensoLogic Software Package软件定标并验证。本试验主要利用标准正态变量(standard normal variate,SNV)+二阶导数(second derivative,2D)和2D的散射处理结合PLSR数学处理消除NIRS采集过程中样品自身或者外界干扰,减弱光谱图基线漂移或者偏移现象的发生,提高光谱精确性及分辨率,从而选出较科学的主成分,以便在复杂分析环境中对被测样品的成分进行有效预测。
1.3.3 NIRS评价参数定标集和验证集根据4 : 1的配比关系[8],分别选用71份和18份全株玉米原料样品。根据其营养成分含量的化学值,将定标样品选择在最大值和最小值之间[9]。各个营养成分的定标评价参数为:定标标准差(SEC)、定标决定系数(1-VR)和交互验证标准差(SECV)[10],验证评价参数为:验证标准差(SEP)、验证决定系数(RSQv)和平均偏差(Bias)[8, 10]。然后根据上述参数确立最优模型[11]。
1.3.4 NIRS评价参数计算方法SEC:通过建立的定标模型对定标样品集进行预测,获得化学测定值和近红外预测值的标准偏差[11]。
SECV:定标过程中,进行交叉验证时所获得的近红外预测值与化学测定值的标准偏差,通过SECV可以大致评估定标模型的预测准确度[11]。
1-VR:定标过程中,进行交叉验证时所得到的相关系数,即模型对样品集浓度变化所能描述的百分率。如果1-VR=1,说明在交叉验证过程中,定标样品浓度变化被100%的解释[11]。
SEP:其报警限为SEC的1.3倍[11]。
RSQv:定标模型对定标样品集变异所能描述的百分率。如果RSQv=1,意味着定标集浓度变化被100%的解释[11]。RSQv返回相关系数(r)2,r的公式如下:
式中:x和y分别为验证集某样品某一成分的化学值和近红外预测值。
Bias:其报警限为SEC的0.6倍[11]。
1.4 统计分析使用Excel 2016对试验数据进行初步整理,利用SPSS 17.0对数据进行描述性统计,并对验证样品的分析值和预测值进行回归分析。
2 结果与分析 2.1 全株玉米原料常规营养成分含量由表 1可知,全株玉米原料的DM、Starch、Ash、CP、EE、NDF、ADF、ADL、NDIP、ADIP和SP含量的平均值分别为32.55%、25.87%、4.49%、7.08%、2.58%、45.59%、20.26%、2.24%、1.39%、0.40%、2.22%。从变异系数上看,DM、CP、Starch、NDF、ADF、ADL和ADIP的变异系数分别为13.12%、10.21%、11.77%、10.97%、14.25%、14.92%和13.66%,均小于15%;而Ash、EE、NDIP和SP的变异系数分别为27.48%、20.55%、25.90%和27.59%,均大于15%,变异范围较大。
由表 2可知,全株玉米原料的CHO体系中,CHO、NFC、CB1、CB3和CC的变异系数分别为2.12%、14.47%、11.7%、1.96%和11.96%,但CB2的变异系数较大,为49.31%。
全株玉米原料的蛋白质体系中,PB1的变异系数为12.30%,其余成分的变异系数均大于15%,变异范围较大。
2.3 全株玉米原料NIRS图本试验所用89份全株玉米原料通过PSS-HA-03 NIRS分析仪扫描得到原始光谱,如图 1所示。NIRS的分析基础是样品化学组成的官能团在近红外区有特征吸收,其吸光度与样品中成分含量的高低相关。从图 1可以看出,在850~1 650 nm光谱范围内,全株玉米原料在不同波长处有不同的吸收峰。通过2D处理光谱图,具体如图 2所示。2D处理可以使特征吸收峰的差异更加显著,本试验在1 300~1 500 nm之间吸收峰强度最明显。
表 3列出了利用NIRS分析技术建立的全株玉米原料营养成分的最优模型参数,其营养成分的1-VR均≥0.87,而1-VR超过0.80时,其模型可用于外部验证。
通过RSQv、标准差/预测均方差(SD/RMSEP)和Bias,对之前选出的全株玉米原料的定标集样品所做出的最优模型进行外部验证,以评价NIRS对全株玉米原料实际预测的效果,进一步验证最优模型能不能应用于实际生产中。由表 4可知,CP、NDF、ADF和CB2的RSQv均在0.90以上,这几种组分NIRS模型的SD/RMSEP都大于3。NDIP、CC和PC的RSQv分别为0.878 9、0.873 5和0.881 6,其NIRS模型的SD/RMSEP分别为13.28、4.79和4.00,远高于3。DM、Ash、ADL、ADIP、SP、NFC、CB1、CB3和PA2的RSQv均大于0.85,而SD/RMSEP均高于2,但低于3。EE和PB1的RSQv大于0.85,分别为0.876 1和0.882 0,其SD/RMSEP比较低,只有1.01和0.19。上述营养成分的RSQv均大于0.85,初步认为这些模型均可用于牧场的生产实践中。
全株玉米原料是反刍动物粗饲料的主要来源之一,且其营养组成对青贮发酵及营养价值起着决定性作用[12]。许多研究表明,玉米的营养成分含量与青贮产量存在一种微妙的平衡关系,并受到玉米品种及生长年份等影响[13]。本试验测得全株玉米原料的DM、Ash、CP、EE、Starch、NDF、ADF和ADL含量的平均值分别为32.55%、4.49%、7.08%、2.58%、25.87%、45.59%、20.26%和2.24%。和立文[14]研究不同品种的全株玉米原料的DM、Ash、CP、EE、Starch、NDF、ADF含量分别为38.32%、4.80%、8.57%、2.01%、27.64%、46.21%和22.59%,本研究测定的结果与其研究结果相比较,DM、Ash、CP、Starch、NDF和ADF含量较低,EE含量较高。此外,Ash和EE的变异系数也较高,分别为27.48%和20.55%,造成这种差异的原因可能与玉米籽粒的品种、收获成熟时期和种植条件等因素密切相关[15]。
众所周知,粗饲料营养成分NIRS分析已经非常成熟。大量研究认为NIRS模型需要试验样品的RSQv≥0.84[10],且1-VR>0.80[16],本试验研究通过NIRS成功建立了DM、Ash、CP、EE、DNF、ADF和ADL 7种概略养分的模型,其决定系数均大于0.87。这说明该技术具有较高的准确度,能代替常规的化学分析方法。目前,对概略养分CP、CF和Ash的预测模型较为成熟,成功建模的研究报道比较多。李洁等[17]利用可见/近红外漫反射光谱分析法获得了较好的CP和DM含量预测模型,其1-VR分别为0.983 6和0.887 8;Modroño等[18]使用2种便携式NIRS对CP和CF含量建立了较好的预测模型,其1-VR分别为0.88~0.90和0.85~0.91;杜雪燕等[19]建立了天然牧草中CP、NDF和ADF含量预测模型,交叉验证相对分析误差(RPDCV)均大于3,1-VR均在0.9以上,这与本试验NIRS模型对全株玉米原料CP、NDF和ADF的预测结果相一致。这说明所建立的这几种组分的NIRS模型定标效果好,预测精度高,可用于这几种组分的实际分析。
3.2 全株玉米原料CNCPS各营养成分特点及NIRS模型建立在研究反刍动物瘤胃发酵规律和饲料营养成分分析方法的基础上,CNCPS体系结合了饲料营养成分的化学分析与反刍动物瘤胃消化利用,使饲料营养价值评价结果对实际生产具有更高的参考价值。粗饲料中CHO是反刍动物主要的能量来源。CB1成分经瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸,从而为奶牛提供能量,本研究中全株玉米原料的CB1含量为25.87%,较和立文[14]研究结果偏低,这可能是因为样本品种和样本采集时期不同造成的。CB3属饲料中可被反刍动物利用的细胞壁,本试验中全株玉米纤维饲料的CB3含量为41.62%,高于天然牧草的5.25%[19]。而CNCPS体中CC是不能被反刍动物利用的CHO成分,其含量过高对反刍动物生产性能产生直接的影响。本试验中全株玉米原料的CC含量的平均值为5.38%,说明本研究中全株玉米原料在瘤胃中的降解率较快,利用效率较高。
全株玉米原料CNCPS中的蛋白质含量除PB1外,其他成分含量变异系数均较大,如前文所述,这可能是由于全株玉米原料的来源地和收割时全株玉米的成熟度不同所导致的。大量研究结果表明,CNCPS中饲料成分的化学分析与反刍动物瘤胃的消化利用呈显著相关性[19]。研究认为粗饲料中PC主要与ADL相互结合,无论在反刍动物的瘤胃还是消化道均未降解,PC含量越少,说明反刍动物对粗饲料的可利用性越高[20]。本试验测得全株玉米原料的PC含量较低,这表明全株玉米原料对反刍动物具有较高的利用价值。周俊华等[21]应用CNCPS评定广西水牛常用粗饲料的营养价值,其结果表明,PA对反刍动物具有较高的营养价值。PA含量较高,可以为瘤胃微生物提供充足的氮源。本研究中全株玉米原料的蛋白质成分PA2含量为2.20%,高于周俊华等[21]测得PA2含量为1.51%的玉米秸秆。这说明全株玉米原料与其他秸秆饲料相似,含有相对较高的可溶性真蛋白质,在瘤胃中降解速率较快,有较好的饲用价值。
杨方等[22]研究玉米籽实中PB1、PB2、PA和PC的含量分别为0.15%、0.34%、0.57%和0.53%。与前者相比,本试验结果具有更强的优势,所建立的CHO体系中的CHO、NFC和CB3的1-VR均大于0.90,且RSQv大于0.88,CB1、CB2和CC的1-VR>0.80,RSQv≥0.84,PB1、PB2和PC的1-VR均大于0.90,真实值与预测值的RSQv均大于0.88。因此,全株玉米原料CHO和蛋白质体系中的预测模型均可用于生产实践。本研究在样品采集过程中执行统一的采样方法和部位,样品采集时间集中在2个月之内,采样地点集中于北京市,有可能减少了出现差异性较大样品的可能性;样品每一指标的检测过程由同一个人完成,也避免了检测中因为人员变动造成的误差。这也提示了在NIRS建模过程中,对样品的采集需要建立技术规范,确保采集过程的一致性;化学检测需要检测人员、设备保持稳定,从而提高模型的准确性。本试验所建立的NIRS模型采集了71个样品的数据,为了提高模型的准确性和适用范围,今后需要不断扩充样品数据库,扩大样品采集的地域和玉米品种范围[23]。
本试验通过概略养分分析法对全株玉米原料营养价值进行初步评定后,利用CNCPS对其所含的CHO和蛋白质成分进行详细分析,使其结果更有参考价值[7]。在实际生产中,将全株玉米原料营养成分含量导入CNCPS配方软件,应用计算技术为反刍动物编制饲料配方,在生产中更有指导意义[24]。
4 结论① NIRS分析技术对全株玉米原料常规营养成分、CNCPS中蛋白质和CHO成分均具有较好的预测能力,且精确度较高。
② 本试验通过NIRS分析技术建立了北京市全株玉米原料营养成分含量模型,参数如下:DM、CP、ADIP、SP、CC、PA2和PB2的NIRS模型参数均采用SNV+2D处理;Ash、EE、NDF、ADF、ADL、NDIP、CHO、NFC、CB1、CB2、CB3、PB1和PC的NIRS模型参数均采用2D处理;且上述成分的1-VR>0.80、RSQv≥0.84;在实际生产中可用于快速评定全株玉米原料上述成分的含量。
③ 本研究为全株玉米原料在反刍动物饲粮营养价值评定中的应用提供基础化学分析数据,并通过NIRS分析技术建立了营养成分快速预测模型。
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