2. 国家生猪种业工程技术研究中心, 广州 510642;
3. 华南农业大学动物科学学院, 广州 510642
2. National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, Guangzhou 510642, China;
3. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
人参是我国传统的名贵中草药，是多年生草本植物，具有“百草之王”的美誉[1-2]。人参中的主要化学成分包括皂苷、多糖、蛋白质、氨基酸和多肽及其衍生物等。多糖是人参的有效成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤和降血糖等生物活性[3]。人参叶史载于《本草纲目拾遗》[4]，称其具有“补中带表，大能生胃津，祛暑气，降虚火，利四肢头目；醉后食之，解醉”的功效。研究表明，人参叶与人参根的药理作用非常相似，对肿瘤、神经系统疾病、白细胞减少症等各类疾病有较好的辅助或治疗效果[5]。陈凌锋等[6]研究发现，太子参茎叶多糖能提高断奶仔猪的肠道免疫功能，维持肠道的微生态平衡。Hwang等[7]研究发现，人参叶多糖(ginseng leaf polysaccharide，GLP)能够促进小鼠的体液免疫和细胞免疫。南慧静等[8]研究发现，人参茎叶多糖口服液能提高小鼠的免疫功能和抗疲劳性。目前，人参叶多糖的相关研究尚少，尤其缺少其在禽类实际应用上的报道，因此，本文选择了当地的优质品种粤黄鸡作为试验对象，研究人参叶多糖对1~28日龄粤黄鸡免疫性能的影响，旨在为人参叶多糖在禽类的实际应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料及仪器试验所用的黄芪多糖(多糖含量≥45%，生产批号：1005256)由爱迪森生物科技有限公司提供，人参叶多糖(多糖含量≥45%，生产批号：20160501)由广东温氏大华农生物科技有限公司动物保健品厂提供。白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、自然杀伤(NK)细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。
主要试验仪器包括全自动生化仪(迈瑞BS-5800M)、高速冷冻离心机、多功能酶标仪、移液枪、恒温培养箱、酒精灯、注射器等。
1.2 试验设计及饲养管理选取1日龄健康粤黄鸡——伊莎品系(母鸡)600只，随机分成5个组，每组8个重复，每个重复15只鸡，经统计检验，各组间试验鸡的平均体重差异不显著(P＞0.05)。A组为空白对照组，饲喂基础饲粮；B组为阳性对照组，黄芪多糖添加量为基础饲粮的0.020%；C、D、E组为人参叶多糖组，人参叶多糖添加量分别为基础饲粮的0.005%、0.010%、0.020%。多糖均采用饮水添加饲喂。试验期为28 d。
饲养方式采用3层笼养式，每天定时将多糖溶于试验鸡的饮水中饲喂2次，试验鸡只自由采食饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。第1周鸡舍内温度保持在33~34 ℃，以后每周降低2 ℃，直至降低到20 ℃左右的室温。给予充足自然光照，保持鸡舍清洁卫生和空气流通，其他按正常饲养管理进行。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
在试验的第14、21和28天，每天09:00开始进行样品采集(提前8 h断料)，每个重复随机选取1只鸡，称重记录后，采血2 mL，置离心机3 000 r/min离心15 min分离血清，于-20 ℃保存待测。采血后颈部脱臼致死，解剖采集胸腺、脾脏和法氏囊组织称重，计算器官指数，组织样保存于-80 ℃备用。
1.4 指标检测免疫器官指数：将试验鸡整鸡称重，分离胸腺、脾脏、法氏囊，剥离周围脂肪后用滤纸吸干水分后称重。按如下公式计算：
器官指数(g/kg)=器官重量(g)/活体重(kg)。
血清生化指标：检测28日龄的试验鸡血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素氮(UN)、肌酐(CRE)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性，用全自动生化仪对各项指标进行检测。
血清免疫指标：用ELISA方法对血清中的IL-2、L-12、TNF-α、IFN-γ、NK细胞含量进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。
1.5 数据统计与分析用SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析，使用单因子方差分析(one-way ANOVA)进行，试验结果使用平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 人参叶多糖对粤黄鸡免疫器官指数的影响如表 2所示，14日龄时，E组胸腺指数显著高于A组(P＜0.05)；D组胸腺指数有所下降，显著低于B、E组(P＜0.05)。21日龄时，各组胸腺指数差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，E组胸腺指数高于其他各组，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 2 人参叶多糖对粤黄鸡胸腺指数的影响 Table 2 Effects of ginseng leaf polysaccharide on thymus index of Yuehuang chickens |
如表 3所示，14日龄时，D组脾脏指数显著高于A组(P＜0.05)；其他各组脾脏指数均高于A组，但差异不显著(P＞0.05)。21日龄时，各组脾脏指数差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，B组脾脏指数显著高于A组(P＜0.05)；其他各组脾脏指数均高于A组，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 人参叶多糖对粤黄鸡脾脏指数的影响 Table 3 Effects of ginseng leaf polysaccharide on spleen index of Yuehuang chickens |
如表 4所示，14日龄时，E组法氏囊指数显著高于其他各组(P＜0.05)。21日龄时，各组法氏囊指数差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，B组法氏囊指数显著高于A组(P＜0.05)；其他各组法氏囊指数与A组无显著差异(P＞0.05)。
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表 4 人参叶多糖对粤黄鸡法氏囊指数的影响 Table 4 Effects of ginseng leaf polysaccharide on bursa of Fabricius index of Yuehuang chickens |
如表 5所示，人参叶多糖组与A组的血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、肌酐、尿素氮含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性均无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 人参叶多糖对粤黄鸡血清生化指标的影响 Table 5 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum biochemical index of Yuehuang chickens |
如表 6所示，14日龄时，C、D、E组与A组的血清中IL-2含量差异不显著(P＞0.05)；B组血清中IL-2含量显著高于其他各组(P＜0.05)。21日龄时，B、C、D、E组血清中IL-2含量均显著高于A组(P＜0.05)。28日龄时，D、E组血清中IL-2含量显著高于A组(P＜0.05)。
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表 6 人参叶多糖对粤黄鸡血清中IL-2含量的影响 Table 6 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum IL-2 content of Yuehuang chickens |
如表 7所示，14日龄时，C、D、E组血清中IL-12含量均显著高于A组(P＜0.05)。21日龄时，A组血清中IL-12含量显著高于其他各组(P＜0.05)。28日龄时，C组血清中IL-12含量最高，但与A组差异不显著(P＞0.05)；E组血清中IL-12含量显著低于A组(P＜0.05)。
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表 7 人参叶多糖对粤黄鸡血清中IL-12含量的影响 Table 7 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum IL-12 content of Yuehuang chickens |
如表 8所示，14日龄时，C、E组血清中TNF-α含量显著高于A组(P＜0.05)。21日龄时，D组血清中TNF-α含量显著高于A组(P＜0.05)；B、C、E组血清中TNF-α含量高于A组，但差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，B、C、D、E组血清中TNF-α含量显著高于A组(P＜0.05)。
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表 8 人参叶多糖对粤黄鸡血清中TNF-α含量的影响 Table 8 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum TNF-α content of Yuehuang chickens |
如表 9所示，14日龄时，C、D、E组血清中IFN-γ含量显著高于A、B组(P＜0.05)；21日龄时，C组血清中IFN-γ含量显著低于其他各组(P＜0.05)，其他各组之间差异不显著(P＞0.05)。28日龄时，D、E组血清中IFN-γ含量显著高于其他各组(P＜0.05)。
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表 9 人参叶多糖对粤黄鸡血清中IFN-γ含量的影响 Table 9 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum IFN-γ content of Yuehuang chickens |
如表 10所示，14日龄时，D组血清中NK细胞含量显著高于其他各组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)。21日龄时，各组血清中NK细胞含量均无显著差异(P＞0.05)。28日龄时，E组血清中NK细胞含量显著高于其他各组(P＜0.05)，其他各组间无显著差异(P＞0.05)。
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表 10 人参叶多糖对粤黄鸡血清中NK细胞含量的影响 Table 10 Effects of ginseng leaf polysaccharide on serum NK cell content of Yuehuang chickens |
胸腺、脾脏和法氏囊是禽类最重要的免疫器官，参与禽类全身的细胞免疫和体液免疫[9]。免疫器官的发育状况很大程度影响机体的免疫功能和抗病能力，其重量是自身细胞的生长发育和分裂所致，免疫器官指数可反映免疫器官的发育情况和免疫细胞的功能状态，间接地反映机体的免疫水平[10-11]。因此，脾脏指数、法氏囊指数及胸腺指数是反映家禽免疫功能的重要指标，其指数升高提示器官的免疫水平提高。
李洪武等[12]研究发现，在基础饲粮中添加0.5%、1.0%、1.5%的人参叶多糖饲喂肉仔鸡，能不同程度地提高肉仔鸡的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数。赵萧萧[11]研究发现，人参叶多糖能显著提高正常小鼠的胸腺指数和脾脏指数。贾执瑛等[13]研究发现，饮水添加200 mg/kg的人参多糖显著提高了大鼠的肾上腺指数和胸腺指数。以上研究说明，人参和人参叶多糖能影响动物免疫器官的发育，在不同阶段对不同器官的影响程度不同。本试验结果与前人对不同植物多糖的研究研究结果基本一致。本试验结果表明，0.020%人参叶多糖能显著提高14日龄粤黄鸡的胸腺指数，其添加剂量人参叶多糖不同程度地提高了14、21、28日龄粤黄鸡的胸腺指数；0.010%人参叶多糖能显著提高14日龄粤黄鸡的脾脏指数，其他剂量人参叶多糖能不同程度地提高14、21、28日龄粤黄鸡的脾脏指数；0.020%人参叶多糖能显著提高14日龄粤黄鸡的法氏囊指数，其他添加量人参叶多糖对粤黄鸡法氏囊指数影响不大。结果说明，人参叶多糖能够促进1~28日龄粤黄鸡的胸腺、脾脏和法氏囊的发育，但不同剂量的人参叶多糖对不同器官的影响程度不同。
3.2 人参叶多糖对粤黄鸡血清生化指标的影响血清总蛋白包括血清白蛋白和球蛋白，其生理功能是维持血浆正常渗透压、运输营养、维持血浆酸碱度恒定、保证机体的新陈代谢。血清白蛋白由肝脏合成，通常检测血清白蛋白含量可以反映肝脏的健康情况。谷丙转氨酶和谷草转氨酶在氨基酸的分解合成代谢中起重要作用[14]。谷丙转氨酶和谷草转氨酶主要存在肝细胞中，二者活性变化是评定肝功能的重要指标，肝功能受损时会导致其活性升高[15]。本试验结果表明，各人参叶多糖组的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性与空白对照组相比均无显著差异，说明在使用人参叶多糖期间粤黄鸡的肝脏发育良好，人参叶多糖不会给机体代谢造成不良影响，而且不会损伤肝脏细胞。
肌酐是肌肉代谢的终产物，当肾脏发生病变或肾功能不全时，会造成肌酐蓄积，形成有害毒素；尿素氮是蛋白质代谢终产物，当肾脏受到损坏时，血清尿素氮含量会升高，肌酐和尿素氮都是评价肾功能好坏的重要指标[16]。本试验结果表明，各人参叶多糖组的血清肌酐和尿素氮含量与空白对照组相比有些许上升，高剂量时血清尿素氮含量有所增加，但均无显著差异，可能更高剂量的人参叶多糖会影响粤黄鸡的蛋白质代谢功能。
3.3 人参叶多糖对粤黄鸡血清中免疫因子含量的影响IL-2是T细胞旁分泌和自分泌的生长因子，可以维持T细胞在体外的生长，IL-2是维持细胞免疫功能的重要因子，能激活NK细胞的增殖和细胞活性。张芳毓等[2]研究发现，人参茎叶多糖能显著提高褐蓝蛋雏鸡空肠中IL-2含量。姚莉媛[17]研究发现，人参多糖能显著提高母猪泌乳初期乳汁中及仔猪初生期血清中IL-2、IL-6 mRNA的表达水平。Zhang等[18]研究发现，人参茎叶多糖能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，显著提高IL-2 mRNA的表达水平，对小鼠淋巴细胞具有免疫增强作用。人参皂苷是一种酸性多糖，Ko等[19]研究发现，人参皂苷能显著提高小鼠脾细胞中IL-2的分泌。这说明从人参中提取的多糖能增加机体不同器官组织中IL-2的含量。本试验结果表明，人参叶多糖能提高14、21、28日龄粤黄鸡血清中IL-2含量，其中剂量为0.010%、0.020%时效果较好，说明人参叶多糖能够通过促进IL-2的分泌而提高机体的免疫性能。
IL-12又叫做细胞毒淋巴细胞成熟因子，主要来源于B淋巴细胞系[20]。IL-12主要作用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞，能有效刺激CTL和NK细胞的活性，并且能够诱导NK细胞和T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子，IL-12含量的减少可间接导致IFN-γ含量的降低[21-22]。商云霞等[23]研究发现，5 g/L的复方中药多糖能有效提高鸡外周血中的IL-12含量，达到调剂机体免疫的作用。朱晓庆[24]研究发现，中药复方多糖促进淋巴细胞增殖和细胞因子IL-12分泌。余强[25]研究发现，黑灵芝多糖能够提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖水平，增强NK细胞活性，促进细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-12分泌。然而目前尚未发现人参叶多糖对动物血液中IL-12分泌量影响的相关报道。本试验结果显示，各添加量的人参叶多糖均显著提高了14日龄粤黄鸡血清中IL-12含量，这说明人参叶多糖能促进1~14日龄粤黄鸡IL-12的分泌。
TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，TNF-α能够刺激单核细胞和其他类型细胞产生细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α本身等[26]；还能刺激淋巴细胞产生抗体，诱导合成集落刺激因子，TNF-α类似于IFN-γ的抗病毒作用，可促进靶细胞表达主要组织相容性复合体-Ⅰ(MHC-Ⅰ)类分子，增强CTL介导的对病毒感染细胞的裂解[27]。孙伟丽等[28]研究发现，饲粮中添加50~100 mg/kg人参多糖可改善冬毛期雄性水貂的肠道形态结构，同时可提高血清中IL-6和TNF-α含量。孙加节等[29]研究表明，在仔猪饲粮中添加人参复合多糖可以促进仔猪白细胞中IL-6和TNF-α的mRNA表达。贾执瑛等[13]研究发现，人参多糖能显著提高大鼠血浆中TNF-α含量，显著提高了大鼠的肾上腺指数和胸腺指数。本试验结果表明，不同剂量的人参叶多糖均能提高粤黄鸡14、21、28日龄粤黄鸡血清中TNF-α含量，0.010%的添加剂量效果较好。
干扰素是人们在研究抗病毒机理时发现的，干扰素能诱导细胞产生抗病毒活力，还能够增加免疫球蛋白G(IgG)的Fc受体(对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体)的表达。Fc受体表达的增加有利于巨噬细胞对抗原的吞噬、NK细胞的的杀伤力以及淋巴细胞的激活，因此增强机体的免疫应答能力[26]。Shin等[30]研究发现，用人参多糖处理小鼠巨噬细胞能显著促进其分泌TNF-α、IFN-γ、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)，人参多糖对居室细胞具有免疫增强作用。Nakada等[31]研究发现，BALB/c小鼠口服人参养荣汤，能使其脾细胞中IFN-γ的分泌量增加。张皖东等[32]研究发现，人参多糖和猪苓多糖能促进大鼠肠道黏膜淋巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ。本试验结果显示，14、28日龄时，人参叶多糖能提高粤黄鸡血清中的IFN-γ含量，其中剂量为0.010%、0.020%时效果显著。这说明人参叶多糖可以促进机体IFN-γ的分泌。
NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，NK细胞能直接识别和杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞和较大的病原体，活化的NK细胞能分泌IFN-γ等细胞因子，增强机体的免疫应答[33]。李敬双等[34]研究发现，苜蓿多糖能显著增加小鼠NK细胞对K562靶细胞的杀伤力。Yang等[35]的试验表明，石斛兰多糖能增加NK细胞的活性和巨噬细胞的吞噬能力，诱导脾细胞产生细胞因子。史坤[36]研究发现，不同浓度的甘草多糖对免疫细胞的增殖具有一定刺激作用，适当浓度的甘草多糖溶液使NK细胞的活性有显著提高。本试验结果表明，0.010%人参叶多糖显著提高了14日龄粤黄鸡血清中NK细胞含量，0.020%人参叶多糖显著高了28日龄粤黄鸡血清中NK细胞含量，其他剂量人参叶多糖与空白对照组相比无显差异，说明人参叶多糖能不同程度地提高粤黄鸡的NK细胞含量。
4 结论在本试验条件下，饮水饲喂人参叶多糖可以促进粤黄鸡的免疫器官发育和相关细胞因子的分泌，从而改善粤黄鸡的免疫性能，人参叶多糖的添加量为0.010%、0.020%时均能取得较好的效果。
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