沙棘(sea buckthorn)是一种胡颓子科沙棘属植物，主要分布在欧洲和亚洲温热带地区。我国是沙棘种植最多的国家之一，目前野生沙棘种植面积覆盖130万hm²，占世界沙棘总面积的90%以上^[1]。据蒙药和藏药记载，沙棘具有祛痰、健脾养胃和破淤止血等功效，常被用于放射损伤、癌症和心脏病等临床治疗。Wani等^[2]研究结果表明，沙棘含有多种具有抗氧化的生物活性成分，包括山奈酚、异鼠李素、槲皮素、原花青素和类胡萝卜素等十余种，是目前自然界发现的最具有功能性和治疗性食物来源之一。除了医疗用途，沙棘果大部分被用来加工成食品，例如果汁、果酱、食品添加剂和果冻。沙棘果渣(SBP)是从沙棘浆果肉质组织中提取果汁剩下的部分，它仍然含有很多有价值的营养物质，例如维生素、生育醇、类黄酮、特殊脂肪酸和丰富的氨基酸(AA)。此外，它还含有高度可消化的碳水化合物，尤其是非纤维性碳水化合物(NFC)、粗脂肪和淀粉。刘绪川等^[3]对SBP和枝叶进行了毒理试验，结果表明沙棘叶及沙棘制品残渣营养丰富，长期饲喂动物安全可靠，无蓄积性毒害，有利于动物的生长发育，是质优价廉的新型饲料原料。Ma等^[4]的试验数据表明，0.1%左右的沙棘黄酮类化合物可以降低肉鸡腹部脂肪含量及甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白含量，以及增加不饱和脂肪酸的含量。辛晓斌等^[5]试验结果表明，添加一定量的SBP有利于育肥羊的生长发育，并提高了肌内不饱和脂肪酸的含量。SBP已在动物生产中利用，但是研究其对反刍动物瘤胃体外发酵和营养物质降解的影响还是少之又少。因此，本试验采用体外产气法和尼龙袋法对不同SBP添加水平的全混合日粮(TMR)进行评价，研究其不同添加水平对饲粮在瘤胃体外发酵产气情况和营养物质降解程度的影响，为SBP在反刍动物生产应用提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 SBP

本试验所用的SBP由山西省右玉县当地沙棘果汁厂提供。SBP含有沙棘果皮和沙棘籽，其营养组成见表 1。

1.2 试验设计与饲养管理

试验选用6只健康、1.5岁左右、体重30~45 kg、安装瘤胃瘘管的杜×寒杂交F₁肉羊羯羊。在进行试验之前，对瘘管羊进行5 d的预饲。正试期每天07：00、17:00饲喂2次颗粒料，自由饮水，试验期间保持不变。对照组为全混合日粮，参考NRC(2007)中体重20 kg、日增重300 g/d的公羊营养需要量进行配制，其中粗饲料为燕麦秸秆、土豆菀；试验组在全混合日粮中分别添加8%(8SBP组)、16%(16SBP组)、24% SBP(24SBP组)。试验饲粮组成及营养水平见表 2。

1.3 体外产气法 1.3.1 试验设备仪器

DHP-9162型恒温培养箱(上海华联医疗器械有限公司)、玻璃注射器(德国Harberle公司)、分液装置(德国Poulten and Graf GmbH)、瘤胃液分装瓶和培养液分装槽(北京正方兴达科技发展公司)等。

1.3.2 人工唾液配制

按照Menke等^[6]的方法配制：A液，CaCl₂·2H₂O 13.2 g、MnCl₂·4H₂O 10.0 g、CoCl₂·6H₂O 1.0 g、FeCl₃·6H₂O 8.0 g，用蒸馏水溶解冷却，定容至100 mL；B液，NH₄HCO₃ 4.0 g、NaHCO₃ 35.0 g、蒸馏水1 000 mL；C液，Na₂HPO₄ 5.7 g、KH₂PO₄ 6.2 g、MgSO₄·H₂O 0.6 g、蒸馏水1 000 mL；D液，刃天青0.1 g、蒸馏水100 mL；E液，NaOH 160 mg、Na₂S₉H₂O 625 mg、蒸馏水100 mL。

1.3.3 试验操作

将添加不同水平SBP的全混合日粮进行粉碎，过40目筛，称量200 mg放入培养管中，每个样品3个平行。于晨饲前2 h从6头瘘管羊中分别采集瘤胃液，用4层纱布过滤导入已经预热的39 ℃保温瓶内。将人工唾液和瘤胃液按照2 : 1混合为体外瘤胃培养液，边搅拌边通入二氧化碳(CO₂)，向每个培养管加入30 mL混合液，并排尽空气，记录相应的初始刻度值，同时做3个空白。将培养管迅速放入39 ℃培养箱中，当培养0、2、4、6、8、12、16、20、24、30、36、48、60、72 h时，记录培养管的刻度值，当刻度值超过80 mL时收集气体，并保存，用于测定CO₂和甲烷(CH₄)产量，发酵终止时，立即用pH计测定pH，发酵液经低温离心，取上清液冷冻保存以备测定挥发性脂肪酸(VFA)、微生物蛋白(MCP)和氨态氮(NH₃-N)浓度。

1.3.4 指标测定

利用气相色谱仪(Aglient 7890B, 美国)测定气体产量；参考Wang等^[7]方法利用气相色谱仪测定VFA浓度；参照亚硝基铁氰化钠-次氯酸钠比色法并利用紫外分光光度计(UV-1800PC, Mapada)测定NH₃-N浓度^[8]；改进王金洛等^[9]的方法测定MCP浓度。

1.4 尼龙袋法

采用孔径为50 μm、面积为10 cm×8 cm的尼龙袋。用粉碎机将添加不同水平SBP的全混合日粮进行粉碎，过40目筛，尼龙袋在烘箱中65 ℃的环境下烘干4 h，用分析天平称量3 g样品放入烘干后的尼龙袋中，用细线将尼龙袋绑在18 cm左右长的软质管上，1根软管上绑1个时间点的2个平行样尼龙袋，软管的另一端系有棉绳，可以固定软管，防止其脱落。

晨饲前，将72 h的尼龙袋放入瘘管内，固定软管。每1种样品3个重复，依次将48、36、24、12、6 h的样品依据相应的时间点放入瘘管羊的瘤胃内，72 h的样品在瘤胃内消化时间到达时将全部取出样品，并放入清水中洗涤，洗涤时要注意不能用力挤压，防止尼龙袋内的样品大量溢出，洗涤直到水不再浑浊即可。将清洗后的尼龙袋放入65 ℃的烘箱内烘干，烘干后回潮24 h，称量被消化后的样品重量，进行计算。

样品中的干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)和粗蛋白质(CP)消失率的计算公式：

瘤胃降解率根据颜品勋等^[10]瘤胃动态降解率参数评定的方法：

式中：p为被测样品在t时的消失率(%)；a为被测样品快速降解的部分(%)；b为被测样品慢速降解的部分(%)；c为慢速降解部分的降解速率(%/h)；t为被测样品降解所用的时间(h)。

根据各个时间点样品内营养物质消失的时间(t)与消失率(p)计算出a、b和c。计算所使用的瘤胃降解程序来自于SPSS 22.0软件。将测定出来的a、b、c以及k的值代入公式中计算各营养物质有效降解率：

式中：ED为样品的有效降解率(%)；a为样品成分快速降解的部分(%)；b为样品成分慢速降解的部分(%)；c为慢速降解部分的降解速率(%/h)；k为被测样品瘤胃外流的速率(%/h)，本试验k值取0.034 h^-1。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel 2007进行初步整理，并用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P≤0.05作为差异显著的判断标准。通过回归曲线估计分析瘤胃降解参数。

2 结果与分析 2.1 饲粮中添加不同水平SBP对体外产气动态变化的影响

由表 3可知，16SBP组72 h产气量和潜在产气量显著高于其他3组(P＜0.05)，16SBP和24SBP组2、4、20、24、30和72 h产气量均显著高于对照组(P＜0.05)，其他时间点各组的产气量以及产气速率均无显著差异(P>0.05)。

2.2 饲粮中添加不同水平SBP对体外瘤胃发酵参数和发酵液VFA浓度的影响

由表 4可知，pH范围在6.48~6.67，随着SBP添加水平的提高，pH随之降低，对照组pH最高，24SBP组pH最低，显著低于对照组(P＜0.05)。与对照组相比，各试验组发酵液NH₃-N和MCP浓度都有上升的趋势，但差异不显著(P＞0.05)。CH₄和CO₂产量的变化不大，24SBP组CO₂产量最高，但组间差异不显著(P＞0.05)。

由表 5可知，各组间丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸浓度和乙酸/丙酸均无显著差异(P＞0.05)。试验组乙酸和总VFA浓度均显著高于对照组(P＜0.05)，16SBP组含量最高，24SBP组次之。

2.3 饲粮中添加不同水平SBP对营养物质瘤胃有效降解率的影响

由表 6可知，与对照组相比，16SBP和24SBP组DM、NDF有效降解率显著提高(P＜0.05)，8SBP和16SBP组CP有效降解率显著提高(P＜0.05)。16SBP和24SBP组DM快速降解部分显著增加(P＜0.05)，16SBP组NDF快速降解部分显著增加(P＜0.05)，16SBP和24SBP组DM慢速降解部分显著增加(P＜0.05)，其他各组的动态参数均无显著性差异(P＞0.05)。

3 讨论 3.1 饲粮中添加不同水平SBP对体外发酵特性的影响

饲粮在瘤胃内发酵主要产生VFA及氨气、CH₄和CO₂等气体。产气量主要与营养水平有关，可发酵营养物质越多，微生物的活性越强，则产气量越大^[11]。因此, 体外总产气量在一定程度上能反映出瘤胃内微生物的发酵状况，且一定时间内发酵产气量的多少反映了底物被瘤胃内微生物的利用程度^[12]。本试验中，试验组72 h产气量高于对照组，且16SBP和24SBP组的产气量较高，但产气速率没产生变化。这说明SBP的添加可以提高饲粮消化率，增加可发酵底物含量，进而导致产气量的增加。

瘤胃液的pH是衡量瘤胃发酵状况的一项重要指标，瘤胃的正常pH为5.5~7.0，pH主要受饲粮结构、唾液分泌、瘤胃发酵产物利用和吸收效率的影响^[13]。如果瘤胃液的pH长期低于6.4，瘤胃微生物的生长、繁殖以及发酵底物的降解和利用都会受到影响。刘艳丰等^[14]研究了沙棘嫩枝叶对绵羊瘤胃发酵特性和血清免疫指标的影响，试验表明随沙棘嫩枝叶添加量的增加，瘤胃液pH呈下降趋势，总VFA的浓度有所增加。本试验对照组和试验组的pH均在正常范围内，与对照组相比，随着SBP添加水平的提高，试验组的pH随之降低，这可能是因为SBP含有大量的酸性物质，增加发酵液的酸度。另一方面，随着SBP添加水平的增加，饲粮中粗饲料比例大幅下降，可发酵营养物质比例增加，因此VFA浓度提高，发酵液pH降低。瘤胃液NH₃-N浓度的高低反映了饲粮中蛋白质在瘤胃中降解的程度和被微生物利用的效率。刘明杰^[15]研究了添加姜粉抗氧化物对肉牛瘤胃发酵、营养物质消化吸收和食糜流通量以及血清抗氧化性能的影响，结果表明瘤胃液pH几乎没有显著变化，NH₃-N浓度呈现先上升后下降的趋势，总VFA浓度随着姜粉的添加而升高，瘤胃液MCP浓度显著提高。瘤胃内NH₃-N的浓度与MCP的合成效率有关，适宜的浓度可以提高MCP的合成效率。有关研究报道，当瘤胃内的NH₃-N浓度在3.3~8.0 mg/dL时，最适宜瘤胃内微生物的生长^[16]。MCP是反刍动物代谢蛋白质的主要来源之一，可以提供大约40%氮源。本试验中，各组的NH₃-N浓度均在适宜范围内，试验组NH₃-N浓度与对照组没有显著性差异，但MCP的浓度显著提高了，且随着SBP的添加水平的提高而升高，说明SBP的添加可以提高MCP的合成速率，促进瘤胃微生物对饲粮中蛋白质的利用。VFA作为动物体内瘤胃发酵的重要产物，可以为动物提供80%的代谢能^[17]。本试验中发酵液中VFA浓度的提高一方面受饲粮结构的影响，另一方面可能与SBP中活性成分(黄酮、维生素A和维生素E等)有关。包玲玲^[18]研究了在绵羊基础饲粮中添加沙葱黄酮类化合物对瘤胃内环境参数的影响，试验表明，沙葱黄酮可以促进MCP的合成和提高瘤胃中总VFA浓度，且降低了乙酸/丙酸。乔良等^[19]研究表明，维生素A和维生素E有提高瘤胃乙酸、丙酸、丁酸以及总VFA浓度的趋势。刘艳丰等^[20]研究显示，沙棘叶黄酮提高了瘤胃食糜中乙酸、丙酸、丁酸和VFA的浓度。另外，饲粮中添加SBP可能会影响瘤胃微生物组成，进而影响发酵产物组成。因此，微生物菌群组成变化还有待于进一步研究。

3.2 饲粮中添加不同水平SBP对瘤胃降解特性的影响

瘤胃养分降解率反映了饲料原料被消化利用的难易程度，是饲料营养成分被动物机体利用程度的重要标志^[21]，有效降解率可以体现饲用价值高低以及被微生物和机体组织所利用的程度。Nuernberg等^[22]研究了SBP的常规养分，其中CP含量为14.6%，NDF含量为39.7%，酸性洗涤纤维(ADF)含量为36.2%，但关于SBP的瘤胃降解参数尚未见报道。本试验选用的SBP中的CP、NDF和ADF含量均低于前者的研究结果，原因可能是沙棘果营养成分及沙棘果汁的加工工艺有差异。本研究中，试验组饲粮中可溶性组分和潜在降解组分含量高于对照组，说明反刍动物有可能获得较高的能量。随着SBP添加水平的提高，降低了玉米、燕麦秸和土豆菀的比例，因此，对照组NDF和ADF含量降低，粗脂肪(EE)的含量增加，且16SBP和24SBP组比例变化最明显。虽然SBP的添加导致饲粮中碳水化合物含量的降低，但SBP中含有较高的NFC，所以对照组的能量与试验组的基本一致。随着SBP添加水平的提高，DM和NDF的慢速降解部分和降解速率增加，DM和NDF有效降解率也增加，原因可能是SBP中的DM本身具有较高的降解性和各组饲粮中含有较高NFC的原因，另外土豆菀ADF、木质素含量较高，在瘤胃中不易被降解，所以对照组饲粮降解率较低。本试验中，CP降解特性变化可能是由于玉米和SBP之间CP含量的差异造成的，而且SBP的增加有可能会抑制蛋白分解菌生长，导致瘤胃内蛋白质分解酶活性降低。

4 结论

饲粮中添加SBP可以提高体外发酵产气量，降低发酵液的pH，并提高发酵液中乙酸和总VFA的浓度，对NH₃-N和MCP浓度没有显著影响；饲粮中添加SBP提高DM、CP和NDF有效降解率。综上，在饲粮中添加SBP可以改善体外发酵和营养物质降解率，其中16%和24% SBP添加水平对体外发酵和营养物质降解影响较大，但实际饲养中添加SBP的水平还需要进一步通过饲养试验确定。