随着全球性气候变暖,高温作为应激因子之一是影响夏季畜禽生产的重要因素。它通过改变机体的各种生理、生化反应,造成畜禽生长和代谢紊乱、免疫力下降及肉品质改变等,给畜牧业造成巨大的经济损失[1],已严重危害畜牧业生产的发展。猪属于恒温动物,皮下脂肪厚,汗腺不发达,体内热能散发较慢,因此对高温异常敏感,极易发生热应激[2]。热应激可使猪的采食量下降、饲料转化率降低、日增重减少、疾病增多、淘汰率与死亡率上升、肉产品品质下降、生产成本提高,已成为养猪业,尤其是规模化猪场在夏季面临的巨大难题[3-6]。
热应激持续时间的长短对机体正常生理生化的影响是有差异的,目前根据时间长短主要分为2类:急性热应激和长期热应激。急性热应激通常也称短期热应激,指热刺激持续时间在7 d之内[7-9];而长期热应激指机体已经暂时适应之后的热应激状态,一般研究涉及的时间点为7、14、21 d等[10-12]。无论是急性还是长期热应激都会对机体的生长、代谢造成一定的影响,也是目前畜牧业亟待解决的问题[13]。
肝脏是机体最重要的组织器官之一,在消化、代谢和免疫防御方面发挥关键作用。营养物质的代谢需要充足的能量供应,线粒体是能量合成的主要场所,而肝脏组织中含有丰富的线粒体,进行活跃的呼吸代谢,因此肝脏代谢极易受到高温环境的影响[14]。
肝脏作为合成脂肪和机体脂质代谢最为活跃的器官,在脂质的摄取、转运、代谢及排泄中发挥着重要作用。本课题组之前的研究发现,持续热应激会引起育肥猪肝脏多条代谢通路的变化,如蛋白质非折叠响应、脂肪酸降解和蛋白质水解等通路[15]。但持续热应激是如何影响肝脏脂肪代谢的,这种影响主要是由于环境高温造成的还是由采食量下降造成的还不清楚。因此,本研究旨在探究持续热应激对生长猪肝脏脂质代谢的影响规律,为今后在营养与环境方面对脂肪代谢进行调控提供一定的参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲养管理选择27头(9窝,3头/窝)体况接近、平均体重为(40.84±2.67) kg的健康大白阉公猪,为保证遗传基础一致,将来自同窝的3头猪随机分至3个组。单笼饲养,自由采食和饮水。试验前对猪舍进行严格消毒,适应期7 d,正试期21 d。环控舱的湿度控制在(55±5)%,光照16 h,强度50 lx,舱内持续均匀通风。
1.2 试验设计及饲粮采用单因素随机区组设计,将27头公猪随机分为3组,每组9头,分别饲养于环境温度为(23.0±0.5) ℃[适温对照组(TN组)]、(33.0±0.5) ℃[热应激组(HS组)]和(23.0±0.5) ℃[采食量配对(PFTN)组]的环控舱内。所有猪均饲喂典型的玉米-豆粕型饲粮,参照NRC(2012)生长猪营养需要并结合生产实际配制。基础饲粮组成及营养水平见表 1。适温对照组和热应激组猪自由采食,而采食量配对组猪的采食量则按热应激组所有猪前1天采食量的平均值饲喂。
分别于试验第3天和第21天,对所有猪前腔静脉采血,肝素钠抗凝,3 000 r/min离心15 min,分离血浆,置于-20 ℃冻存,用于血浆甲状腺激素、脂质含量检测。试验结束后所有猪只电击晕后统一屠宰,宰前禁食12 h,禁水2 h。取肝脏中叶,分割成若干个约1 cm3小块,用预冷的生理盐水冲洗干净后,分装于1.5 mL离心管中,-80 ℃保存,用于脂肪代谢相关酶活性的检测。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能测定试验开始后,每天记录各处理猪只的采食量,并计算试验期内的平均日采食量。在试验的第1天及第22天试验结束时,逐头测定试验猪的始重和末重,并计算各猪的平均日增重。通过平均日采食量及平均日增重,计算料重比。
1.4.2 血浆甲状腺激素含量检测血浆中三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)的含量均采用酶联免疫吸附法测定。所有试剂盒均购自北京华英生物技术研究所。FT3/FT4由血浆中FT3、FT4的含量相比计算所得。
1.4.3 血浆脂质含量指标测定血浆中甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量均采用全自动生化分析仪(日立7080,日本)测定。所用试剂盒购买自四川迈克生物技术有限公司。血浆中游离脂肪酸含量采用比色法测定。测定试剂盒购自北京华英生物技术研究所。
1.4.4 肝脏脂肪代谢酶活性测定称取肝脏100 mg,剪成小块放入组织研磨器中,加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液(PBS),制成匀浆,然后置于-20 ℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后,将组织匀浆于4 ℃、5 000 r/min离心5 min,取上清,采用BCA试剂盒测定匀浆液总蛋白含量。
肝脏中脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶和激素敏感脂酶活性均采用酶联免疫吸附法测定。所用试剂盒均购自北京华英生物技术研究所,试剂盒批内变异系数(CV)<10%,批间CV<15%。肝脏脂蛋白脂酶的活性采用比色法测定。所用试剂盒购自北京华英生物技术研究所,试剂盒批内CV<8%,批间CV<10%。
1.5 数据处理采用SPSS 20.0统计软件进行单因子方差(one-way ANOVA)分析,Duncan氏法进行多重比较,试验数据用“平均值±标准误(mean±SE)”表示,以P < 0.05为差异显著性标准,以0.05≤P < 0.10作为有差异趋势。
2 结果 2.1 持续热应激对生长猪生长性能的影响由表 2可知,与适温对照组相比,热应激组和采食量配对组猪的末重、平均日增重、平均日采食量显著降低(P < 0.05),而料重比则显著升高(P < 0.05)。热应激组与采食量配对组相比,生长性能指标无显著差异(P>0.05)。
由表 3可知,与适温对照组相比,在试验第3天时,热应激组血浆T4、FT3的含量以及FT3/FT4均显著降低(P < 0.05);在试验第21天时,热应激组血浆T4、FT3含量也显著降低(P < 0.05)。而与采食量配对组相比,在试验第3天时,热应激组血浆中仅T4含量显著降低(P < 0.05);在试验第21天,热应激组仅血浆FT3含量显著降低(P < 0.05)。采食量配对组与适温对照组相比,仅试验第3天血浆FT3/FT4出现显著下降(P < 0.05),而其他指标均无显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,与适温对照组相比,在试验第3天,热应激组血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高(P < 0.05),而甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸的含量差异不显著(P>0.05);在试验第21天,热应激组血浆低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高(P < 0.05),游离脂肪酸含量有升高的趋势(P=0.094)。而与采食量配对组相比,在试验第3天时,热应激组血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高(P < 0.05),而甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸含量差异不显著(P>0.05);在试验第21天,热应激组血浆低密度脂蛋白胆固醇含量显著升高(P < 0.05),游离脂肪酸含量有升高的趋势(P=0.094)。采食量配对组与适温对照组相比,血浆各脂质含量均无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,与适温对照组相比,热应激组猪肝脏中脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、激素敏感脂酶和脂蛋白脂酶的活性均显著降低(P < 0.05)。与采食量配对组相比,热应激组猪肝脏中这4种酶的活性均无显著差异(P>0.05)。而采食量配对组与适温对照组相比,这4种与脂肪代谢密切相关的酶活性均显著降低(P < 0.05)。
猪与其他家畜相比散热能力较差,当环境温度超过热中性区上限时,便会产生应激出现不喜采食的行为[16]。当猪处于热环境条件时,猪自身会通过减少采食来减少机体代谢产热从而维持体温的平衡[17-18]。本试验结果发现,与适温对照组相比,生长猪在持续热应激下采食量显著下降。李军乔等[4]研究也表明,热应激会引起采食量的下降,并随着应激强度的加强,体重出现明显降低。由于采食量的下降及营养物质代谢水平降低,进而导致热应激下生长猪的体增重和饲料转化率也显著降低。
3.2 持续热应激对猪血浆甲状腺激素分泌的影响甲状腺激素几乎作用于机体所有的器官和组织,并主要以T3发挥生物学效应,对生长、发育、代谢和组织的分化等各个方面均有影响,它的分泌关系到机体的代谢和产热,是动物体维持基础代谢的重要激素,也是动物调节产热以维持体内热平衡的重要激素。甲状腺激素主要参与机体的物质代谢过程,尤其与机体的体温调节密切相关。畜禽处于长期热应激下,必然会导致甲状腺激素分泌紊乱,体温调节功能下降,进而影响动物的生长和代谢[19-20]。在本试验中,持续热应激猪血浆T4和FT3含量在第3天和第21天均显著降低。这一结论与之前的研究结果[21-22]类似。甲状腺激素含量下降,导致代谢水平降低,产热减少,是猪机体加强抵抗热应激能力的一种适应性调节。热应激时甲状腺素含量的变化被认为是通过下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴来实现的。机体在热应激状态下,下丘脑促甲状腺素释放激素(TRH)分泌减少,引起垂体促甲状腺激素(TSH)分泌减少,HPT轴的活动受到抑制,甲状腺素分泌减少,最终降低机体的基础代谢,减少产热,维持内环境平衡。
3.3 持续热应激对猪脂质代谢的影响血浆甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白含量是反映机体脂代谢的常用指标。其中甘油三酯与饮食关系最为密切,正常情况下,血浆中的甘油三酯保持着动态平衡,而高脂饮食后一般甘油三酯含量就会升高[23]。在本试验中,各组饲粮相同,因此血浆甘油三酯含量差异不显著。肝脏是合成和贮存胆固醇的主要器官,在正常情况下,机体在肝脏中合成和从食物中摄取的胆固醇,将转化为甾体激素或成为细胞膜的组分,并使血液中胆固醇的含量保持恒定。而本试验中,与适温对照组和采食量配对组相比,热应激组在第3天时血浆总胆固醇含量显著升高,而第21天时总胆固醇含量差异不显著。这说明短期的环境高温会引起肝脏胆固醇代谢的异常,此后随着机体自身的调节,胆固醇代谢逐渐恢复正常。
低密度脂蛋白胆固醇是胆固醇中的一种,它的升高表示脂蛋白代谢异常。Kouba等[24]发现,在采食量相似条件下,环境高温提高生长猪血浆中低密度脂蛋白和游离脂肪酸的含量,推测高温可能通过增强肝脏合成低密度脂蛋白的能力直接促进脂肪的沉积。本研究也发现,在采食量相似条件下,持续环境高温提高了生长猪血浆中低密度脂蛋白胆固醇的含量,并有提高血浆游离脂肪酸含量的趋势。肝脏可利用从头合成的脂肪酸或血浆中的游离脂肪酸合成低密度脂蛋白[25]。
乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶为脂肪酸从头合成过程中的关键酶,乙酰辅酶A羧化酶可催化乙酰辅酶A合成丙二酸单酰辅酶A,为脂肪酸的合成提供关键原料;脂肪酸合成酶则可催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸[26]。之前的研究发现,无论是在自由采食条件下[27]还是在采食量相似条件下[28],环境高温都会抑制乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的活性,降低其在肝脏组织中的含量从而导致肝脏脂肪酸的合成受阻。在本试验中,自由采食条件下,热应激抑制了肝脏中乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶的活性,使脂肪(酸)的合成受到抑制。而在采食量相似条件下,单纯的环境高温并没有直接降低猪肝脏脂肪酸的从头合成能力。这说明环境高温降低猪肝脏脂肪酸从头合成能力与采食量的下降有关。
环境高温可通过影响脂肪的合成和分解代谢来影响猪脂肪的沉积[11, 29]。肝脏是体内脂肪酸、胆固醇合成的主要器官之一,也是脂肪运输的枢纽。消化吸收后的一部分脂肪进入肝脏,以后再转变为体脂而贮存。激素敏感脂酶是脂肪组织中重要的脂肪分解酶,但目前关于环境高温对肝脏激素敏感脂酶活性的影响尚不清楚。本试验发现,持续热应激可使生长猪肝脏中激素敏感脂酶的活性显著下降,而在采食量相似条件下环境高温对激素敏感脂酶的活性则无显著影响。激素敏感脂酶是最初动员脂肪分解的关键酶和限速酶,它将贮藏在脂肪细胞中的脂肪逐步水解为游离脂肪酸和甘油三酯并释放入血液。该结果表明持续热应激可造成猪肝脏脂肪分解代谢的紊乱,而这种变化依赖于采食量的下降。
血液中的甘油三酯要被脂肪组织重新利用,首先必须水解为游离脂肪酸,而催化这一反应的酶就是脂蛋白脂酶。作为脂肪分解代谢的关键酶,脂蛋白脂酶催化甘油三酯进行分解释放出脂肪酸,由脂肪组织吸收用于能量贮存或由肌肉组织吸收用于氧化供能。在本试验中,持续热应激可使肝脏中脂蛋白脂酶活性显著下降,但在采食量相似条件下环境高温对脂蛋白脂酶的活性则无显著影响。这一结果与吴鑫等[11]的结果有一定一致性。
4 结论① 短期持续热应激和长期持续热应激均可使生长猪血浆低密度脂蛋白胆固醇含量升高,且这种影响主要是由环境高温引起的。
② 持续热应激可使猪肝脏脂肪合成酶和分解酶活性降低,在一定程度上造成肝脏脂质代谢的紊乱,而这种作用主要依赖于高温引起的采食量下降。
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