新生犊牛因胃肠道系统发育不完全，免疫功能尚未完全建立，15日龄前的腹泻发生率可达14.10%，死亡率可达8.03%，给牧场带来极大的经济损失^[1]。有效预防与缓解腹泻的发生，对犊牛健康、成年后生长性能的发挥以及养牛业的发展至关重要。锌是机体所需的重要微量元素，具有提高免疫、抗炎症和抗氧化等多种生理功能^[2-3]。研究发现，发展中国家幼龄儿童腹泻发生与锌缺乏有关，给其口服含锌补液后腹泻发生率与持续时间降低，对缓解腹泻有一定作用^[4-5]。在畜牧生产中，Poulsen^[6]首次提出饲粮添加3 000 mg/kg氧化锌(zinc oxide，ZnO)可以有效缓解仔猪因断奶应激引起的腹泻发生，并促进其生长。之后大量研究也证实，高剂量(2 000~4 000 mg/kg)氧化锌在缓解断奶仔猪腹泻和促进生长方面具有较好效果^[7-9]。然而高剂量氧化锌的使用使大量未被吸收的锌离子随粪便进入环境，导致环境污染等问题。2016年欧盟1095号文件与2017年我国新修订的《饲料添加剂安全使用规范》明确禁止了高锌的使用，要求犊牛饲粮中锌添加量低于180 mg/kg。然而，现有养殖标准中，对于犊牛饲粮中锌的适宜添加水平尚不明确，有待于进一步研究。鉴于此，本试验旨在研究不同水平氧化锌对新生犊牛生长性能、免疫功能及直肠微生物菌群的影响，为生产中指导无机锌在犊牛早期饲养中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

饲料级氧化锌，纯度为96.64%，锌含量为76.84%，由湖南省衡阳市中宝饲料科技有限公司提供。

1.2 试验动物与试验设计

试验在河北省新乐市鸿运奶牛专业合作社进行。选取健康、体重[(41.6±7.4) kg]相近的新生荷斯坦犊牛24头(8头公犊牛，16头母犊牛)，随机分为4组，每组6头(2头公犊牛，4头母犊牛)。对照组(Zn-0组)犊牛仅饲喂牛奶和开食料；试验组犊牛在饲喂牛奶和开食料的基础上，每日分别添加40(Zn-40组)、80(Zn-80组)、120 mg(Zn-120组)锌，即每日分别添加51.58、103.16、154.74 mg氧化锌。试验从犊牛出生开始，到14日龄结束，共14 d。

1.3 试验饲粮与饲养管理

犊牛出生后2 h内灌服初乳4 L。第2~3天，用奶壶饲喂初乳，每天2次(08:30、16:00)，每次2 L。第4~14天，用奶桶饲喂常乳，每天8 L，第4天开始犊牛添加开食料，自由采食，每天记录采食量。试验期间保证干净、充足水源。氧化锌与牛奶混合后饲喂给犊牛。犊牛开食料组成及营养水平见表 1，牛奶营养水平见表 2。试验开始前对水、牛奶和开食料中锌含量进行了测定，水、牛奶和开食料中锌含量分别为0、4.01和22.97 mg/kg。

1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 牛奶及开食料

试验期间，采集犊牛饮用牛奶和开食料样品，-20 ℃保存。牛奶营养成分使用乳成分分析仪(MilkoScan^TM FT6000)进行测定。开食料测定干物质(DM)[AOAC(2005)，方法930.15]、粗蛋白质(CP)[AOAC(2000)，方法976.05]、粗脂肪(EE)[AOAC(2003)，方法4.5.05]、粗灰分(GB/T 6438—1992)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)^[11]的含量。采用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定水、牛奶和开食料中的锌含量(GB 5009.268—2016)。

1.4.2 体重

分别于犊牛出生和15日龄晨饲前，使用电子秤称量犊牛空腹体重，计算平均日增重(ADG)。

1.4.3 牛奶采食量与开食料采食量

试验期记录犊牛牛奶和开食料摄入量，计算牛奶采食量、开食料采食量、总采食量和料重比(F/G)。

1.4.4 腹泻率的测定

试验期，每天早、晚观察犊牛粪便形态并进行评分^[12]，评分标准如下：0分，硬粪；1分，糊状粪便；2分，成形粪便与液体状粪便混合；3分，液体状粪便，颜色正常；4分，水样粪便，颜色不正常。3、4分记为腹泻。根据记录的犊牛腹泻头数与腹泻持续时间，计算腹泻率：

腹泻率(%)=100×总腹泻头数×腹泻天数/(试验头数×试验天数)。

1.4.5 血清免疫球蛋白含量的测定

犊牛15日龄时，晨饲前进行颈静脉采血10 mL，室温静置30 min，3 000×g、4 ℃离心15 min后制备血清，保存于-20 ℃冰箱备用。血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，试剂盒购于Bethyl公司。

1.4.6 直肠微生物含量的测定 1.4.6.1 取样

犊牛15日龄晨饲前，采集犊牛直肠内容物于2 mL冻存管，保存于-20 ℃，用于直肠内容物中大肠杆菌和乳酸菌含量的测定。

1.4.6.2 微生物纯培养法测定直肠微生物含量

大肠杆菌含量的测定使用GB 4789.3—2016中的大肠菌群平板计数法，乳酸菌含量的测定使用GB4789.35—2010的方法。取1 mL直肠内容物与9 mL生理盐水混合，依次制备10倍系列稀释液。选取10^-4~10^-6稀释度菌液，大肠杆菌接种结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基，37 ℃培养24 h，将培养后菌落数在15~150 CFU平板上的典型和可疑大肠菌群菌落移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管，凡BGLB肉汤管产气，即报告大肠菌群阳性。乳酸菌接种MRS培养基，37 ℃厌氧培养(48±2) h。直肠内容物中大肠杆菌和乳酸菌含量按下列公式计算：

大肠杆菌含量(CFU/mL)=大肠菌群阳性率×计数菌落数×稀释倍数；

乳酸菌含量(CFU/mL)=ΣC/(n₁+0.1×n₂)×d。

式中：ΣC为平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁为第1稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂为第2稀释度(高稀释倍数)平板个数；d为稀释因子(第1稀释度)。

1.4.6.3 实时荧光定量PCR法测定直肠微生物含量

使用实时荧光定量PCR的绝对定量法对大肠杆菌和乳酸菌含量进行测定。首先，使用粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP328]提取粪便微生物总DNA，并测定浓度。以DNA为模板，用目的基因引物进行PCR扩增，引物由Invitrogen公司合成(表 3)。反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收的PCR产物进行TA连接，22 ℃连接约4 h，转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，并涂布平板培养。挑取平板上的阳性克隆进行PCR鉴定，最后提取质粒作为绝对定量的标准品。质粒标准品从10¹~10⁵进行10倍梯度稀释，每个梯度取2 μL做模板建立标准曲线。乳酸菌标准曲线为：Y=-3.457X+37.37(R²=0.99)；大肠杆菌标准曲线为Y=-3.696X+47.579 (R²=0.91)；其中Y为阈值Ct，X为拷贝数。使用Applied Biosystems 7500实时荧光定量仪和TaKaRa SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (TliRNaseH Plus)、ROXplus试剂盒对样本DNA进行定量，每个样品3个重复，根据标准曲线与样品Ct值计算拷贝数。荧光定量体系为18 μL，包括10 μL 2×Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，7 μL灭菌水和2 μL DNA。PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的微生物的数量以每个样品中每克内容物细菌16S rRNA拷贝数的对数值[lg(拷贝数/g)]表示。

1.5 数据统计分析

使用Excel 2007软件对试验数据进行初步处理，腹泻率采用卡方检验进行分析，其他数据采用SAS 9.4软件的GLM模型进行分析。P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示差异有显著趋势。

2 结果 2.1 氧化锌对新生犊牛生长性能和腹泻情况的影响

由表 4可知，饲粮添加不同水平氧化锌对犊牛ADG、牛奶采食量、开食料采食量、总采食量、F/G无显著影响(P>0.05)，Zn-80组犊牛的ADG、牛奶采食量、开食料采食量和总采食量最高。饲粮添加不同水平氧化锌对犊牛腹泻率影响不显著(P>0.05)，但与对照组相比，试验组犊牛腹泻率均有所降低。

2.2 氧化锌对新生犊牛血清中免疫球蛋白含量的影响

由表 5可知，随着饲粮氧化锌添加水平的增加，血清中IgA、IgG和IgM含量线性升高(P < 0.05)。

2.3 氧化锌对新生犊牛直肠微生物含量的影响

由表 5可知，微生物纯培养法结果显示，随着饲粮氧化锌添加水平的增加，直肠中乳酸菌含量线性增加(P < 0.05)，直肠中大肠杆菌含量有线性下降趋势(P=0.078)。实时荧光定量PCR法结果也显示，随着饲粮氧化锌添加水平的增加，直肠中乳酸菌含量线性增加(P < 0.05)，直肠中大肠杆菌含量有线性下降趋势(P=0.080)。

3 讨论 3.1 氧化锌对新生犊牛生长性能与腹泻情况的影响

新生期是犊牛快速生长发育期，促进该阶段犊牛生长发育有助于其成年后生长性能的发挥。采食量、ADG和F/G是衡量动物生长状况的重要指标。采食量高低影响动物摄取营养物质的高低，从而影响ADG，而ADG又对评估动物F/G、整体健康状况等有重要作用^[15]。本试验结果表明，新生犊牛每日锌添加水平为40、80和120 mg时，对其ADG、采食量和F/G没有显著影响。Wright等^[16]研究发现，补饲20 mg/kg硫酸锌对荷斯坦犊牛采食量和ADG无显著影响。Mandal等^[17]给14~15月龄公犊牛补饲35 mg/kg硫酸锌后，其采食量和ADG与对照组间无显著差异。Genther-Schroeder等^[18]研究发现，补饲60 mg/kg氨基酸锌对安格斯杂交牛的采食量和ADG无显著影响。前人研究低剂量锌对犊牛生长性能影响的结果与本试验结果一致。本试验结果表明，饲粮低氧化锌添加水平未能显著提高新生犊牛生长性能，但与对照组相比，Zn-80组犊牛ADG与采食量提高最多。

腹泻是新生犊牛常见疾病，发病率与死亡率较高，威胁着犊牛健康与生长性能的发挥，是牧场亟待解决的问题。高锌有缓解断奶仔猪腹泻的功效，但其对犊牛腹泻影响的报道较少。Glover等^[19]发现，与对照组相比，补饲80 mg氧化锌可以缩短犊牛腹泻的治愈时间。目前，锌对腹泻的缓解作用主要集中在治疗方面，然而最佳的解决方法是预防^[20]。研究发现，给缺锌的发展中国家儿童补锌可有效降低腹泻发生率，从而认为锌对腹泻具有预防作用^[21-22]。本试验从犊牛出生至14日龄就饲喂不同水平氧化锌，研究低水平锌对新生犊牛腹泻的预防作用，结果显示，试验组犊牛腹泻率较对照组相比，差异未达到显著水平，但其数值均有所下降，表明锌对犊牛腹泻的发生可能有一定预防作用。新生犊牛肠道尚未发育完全，绒毛高度低，通透性高，极易受到病原微生物的感染，本试验中锌降低犊牛腹泻率可能与其参与体内胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)信号通路、促进新生犊牛尚未发育完全的肠道的细胞增殖与分化、维持肠道黏膜的完整、保护肠道免受病原菌对其的损伤^[23]有关，具体的作用机制还有待于进一步研究。

3.2 氧化锌对新生犊牛血清中免疫球蛋白含量的影响

研究表明，缺锌会影响机体免疫器官发育，导致树突状细胞T淋巴细胞、前B淋巴细胞的增殖受到抑制，免疫系统清除病原能力下降^[24]。但也有研究表明，高锌会抑制机体的免疫功能^[25-26]。因此，只有适宜添加水平的锌才能有效发挥其对免疫功能的促进作用。免疫球蛋白是动物受到抗原刺激后产生的中和、清除抗原的一类球蛋白。冷静等^[27]研究发现，补饲1 000 mg/kg的氧化锌可以显著提高断奶仔猪血清中免疫球蛋白含量。陈亮等^[28]研究发现，短期饲喂高剂量氧化锌可以促进血清中免疫球蛋白含量的增加。新修订的《饲料添加剂安全使用规范》中规定了犊牛饲粮中锌添加量不超过180 mg/kg。因此，本试验给犊牛每日饲喂不同低水平氧化锌后发现，犊牛血清中IgG、IgA和IgM含量呈线性增加。Satyanarayana等^[29]研究发现，补饲60 mg/kg的有机锌可以增加犊牛血清中的抗体浓度。Parashuramulu等^[30]研究发现，补饲80和140 mg/kg硫酸锌可以显著提高水牛犊抗布氏杆菌体液免疫能力，且二者间不存在显著差异。Dresler等^[31]研究表明，补饲30 mg/kg蛋氨酸锌可以显著提高断奶犊牛血清中总免疫球蛋白含量。Mattioli等^[32]给断奶前犊牛注射锌后，犊牛机体免疫应答显著提高。本试验结果与以上研究结果一致，表明低水平氧化锌对犊牛免疫功能有一定的促进作用，这或许是本试验中试验组犊牛腹泻率下降的原因之一。

3.3 氧化锌对新生犊牛直肠微生物含量的影响

大肠杆菌感染是诱发新生犊牛腹泻的主要原因，威胁着犊牛健康。乳酸菌是动物肠道内的有益菌，能够产生乳酸，维持肠道酸性环境，阻止病原菌的入侵与定植，保护肠道免受损伤^[33]。氧化锌可以缓解腹泻，可能与其影响肠道内大肠杆菌、乳酸菌含量有关。邱磊等^[34]研究发现，高剂量氧化锌可以显著降低断奶仔猪粪便中大肠杆菌含量，对乳酸菌含量则无影响。Starke等^[35]研究发现，高剂量氧化锌可以同时减少仔猪肠道内大肠杆菌和乳酸菌含量。而Li等^[36]的研究结果则显示断奶仔猪粪便中大肠杆菌、乳酸菌含量并未受到高剂量氧化锌的显著影响。另有研究显示，氧化锌会提高肠道内大肠杆菌含量，减少乳酸菌含量^[37]。本试验使用微生物纯培养和实时荧光定量PCR(绝对定量法)2种方法对犊牛直肠内大肠杆菌和乳酸菌含量进行了测定，结果显示，犊牛直肠内乳酸菌含量随着饲粮中氧化锌添加量的增加而线性增加，大肠杆菌含量则有线性减少的趋势。犊牛直肠内容物中微生物含量的改变可能也是促使腹泻率有所下降的原因之一。Shao等^[38]在肉鸡上的已经发现，每日补饲120 mg锌可以显著降低有害菌群数量，增加有益菌数量，与本试验结果一致。而Roselli等^[39]通过体外试验则提出，氧化锌可能是通过抑制大肠杆菌对肠道细胞的黏附与内化而非减少数量来保护肠道细胞免受损害，从而缓解腹泻的。因此，氧化锌降低腹泻率的具体机制仍需进一步探究。

4 结论

① 饲粮添加不同水平氧化锌对新生犊牛ADG、采食量、F/G与腹泻率无显著影响，Zn-80组犊牛ADG最高，腹泻率最低。

② 随着饲粮氧化锌添加水平的增加，血清中IgA、IgG和IgM含量线性升高。

③ 随着饲粮氧化锌添加水平的增加，直肠中乳酸菌含量线性增加，直肠中大肠杆菌含量有线性下降趋势。

④ 在本试验条件下，综合考虑试验结果与锌添加水平受限的情况，犊牛饲粮中每日添加80 mg锌效果较好。