2. 青岛市崂山区农业和水利局, 青岛 266061;
3. 平度市畜牧兽医局, 青岛 266700
2. Agriculture and Water Conservancy Bureau of Laoshan, Qingdao 266061, China;
3. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Pingdu, Qingdao 266700, China
近年来,随着我国奶牛养殖行业的发展,对于奶牛的生产效率、产品质量以及环境保护的要求也愈发提高。但是在实际生产实践中,饲料蛋白质原料匮乏,蛋白质饲料利用率低是制约奶牛提高生产效率的重要因素。蛋白质饲料利用效率低,在造成蛋白质资源浪费的同时,未被利用的氮的排放也加剧了环境的污染。通过营养调控技术提高奶牛蛋白质资源的利用效率、减少氮排泄对于奶牛养殖业更好的可持续发展具有重要意义。
氨基酸营养是反刍动物蛋白质营养的核心,尤其是限制性氨基酸,其平衡与否会直接影响到蛋白质等含氮物质的利用效率,因此可以通过补饲氨基酸,平衡氨基酸比例来提高蛋白质的利用效率以及减少氮排泄。在以玉米、豆粕为基础的饲粮中通常较为缺乏蛋氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)[1]。而蛋氨酸与赖氨酸作为反刍动物第一、第二限制性氨基酸[2-3],对于高产奶牛有着极重要的作用。通过添加过瘤胃蛋氨酸(rumen-protected methionine,RPMet)、过瘤胃赖氨酸(rumen-protected lysine,RPLys)可以减少氨基酸在瘤胃部分的消耗,增加小肠部分必需氨基酸的含量,达到营养调控的目的。杨魁等[4]研究表明,在生长育肥牛中添加RPMet与RPLys,可以促进氮沉积,改善蛋白质利用率。刘飞[5]在泌乳奶牛饲粮中添加RPMet与RPLys后发现,试验组产奶量显著高于对照组,乳成分有提高的趋势。本课题组前期分别对RPMet[6]与RPLys[7]进行了研究,发现在奶牛饲粮中分别单独添加RPMet、RPLys,对于奶牛的微生物蛋白(MCP)产量、产奶量、乳品质以及降低氮排泄方面均具有正向的促进作用。有关RPMet与RPLys联合添加虽有报道,但主要集中在奶牛的产奶性能方面,而针对其能否增加瘤胃MCP产量与降低氮排泄的研究却鲜有报道。因此,本试验通过添加不同水平的RPMet与RPLys组合,探讨RPMet与RPLys不同组合对奶牛瘤胃MCP产量、产奶性能和氮排泄的影响,以期能够找出提高瘤胃MCP产量、产奶性能以及降低氮排泄等方面综合效果最为适宜的组合,同时也为RPMet与RPLys在实际生产中联合使用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试验设计试验所用的RPMet(过瘤胃率为85%)和RPLys(过瘤胃率为70%)均购自青岛润博特生物科技有限公司,其中RPMet为白色颗粒状物质,其组成为DL-蛋氨酸、二氧化硅等,DL-蛋氨酸含量≥60%,水分含量≤12%;RPLys为棕色颗粒状物质,其组成为L-赖氨酸盐酸盐、二氧化硅等,赖氨酸含量≥50%,水分含量≤12%。
试验选用烟台荷牧园牧业有限责任公司年龄(4~5岁)、体重[(640±25) kg]、胎次(2~3胎)、产奶量[(34.2±0.3) kg]、乳成分及泌乳期[(90±15) d]相近的荷斯坦奶牛40头,随机分为10个组,每组4头。对照(C)组饲喂基础饲粮,试验组添加不同水平的RPMet和RPLys,其中RPMet设置3个梯度,分别为22.5、25.0、27.5 g/(d·头),RPLys设置3个梯度,分别为27.5、30.0、32.5 g/(d·头),共9个不同组合,试验设计见表 1。
每头奶牛每天预留0.5 kg精料,作为载体与RPMet和RPLys混合,剩余精料与粗饲料混合均匀后制成全混合日粮(TMR)。TMR组成及营养水平见表 2。RPMet和RPLys与精料混合后再随TMR一起饲喂。整个试验期为75 d,其中预试期15 d,正试期60 d。
每天采用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶3次(04:00、12:00、18:00),每天饲喂TMR 3次(04:30、12:30、18:30),试验牛自由采食,保证每天有20 h以上接触到TMR,自由饮水和运动,并按照常规对其进行驱虫、光照和管理。
1.3 样品采集与指标测定 1.3.1 采食量测定试验牛分栏饲喂,单独记录每头牛的采食量。预试期第1~3天、第5~7天、第9~11天、第13~15天记录每头试验牛的投料量和剩料量,根据每次的投料量和剩料量计算每头牛的采食量。预试期结束后,计算出预试期内平均采食量。正试期内每10 d记录1次采食量,共记录6次,每次连续记录3 d,根据3 d的采食量计算平均采食量,按照每次平均采食量调整下一阶段的TMR投料量。正试期结束后,根据6次采食量计算出正试期内平均采食量,用于计算主要养分采食量。
1.3.2 乳样的采集与测定本试验采用荷兰进口SAC全自动挤奶器挤奶3次(04:00、12:00、18:00),自动显示产奶量,整个试验期内每隔5 d记录1次试验牛的产奶量,连续记录3 d取平均值。在试验正试期的第15、30、45、60天,按早、中、晚4 : 3 : 3的比例共收集50 mL混合乳样,加入30 mg重铬酸钾防腐剂,混合均匀,4 ℃进行保存。乳样采用山东省农业科学院奶牛研究中心生产性能测定实验室的乳成分和体细胞自动分析仪(丹麦Foss公司生产,型号Combi Foss FT+)测定乳样中的乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和乳体细胞数。
1.3.3 TMR样与粪样的采集与测定TMR样的采集:分别在预试期第1~3天、正试期第28~30天和正试期第58~60天时在牛采食通道中采用五点取样法采集TMR样,并将采集的TMR样按四分法进行缩样,在烘箱中65 ℃烘干制成风干样,粉碎备用。粪样的采集:分别在预试期第1~3天、正试期第28~30天、正试期第58~60天采用全收粪法采集粪样3次,单独收集每组4头试验牛粪样,将收集的粪样混匀后称重,用四分法进行缩样,按每100 g粪样加10%硫酸25 mL进行固氮处理后放入-20 ℃冰箱冷冻保存,采样结束后,将3 d内所留的粪样按比例均匀混合,65 ℃烘干至恒重保存。采集的样品采用GB/T 6435—2006[9]测定水分含量,计算干物质(DM)含量;粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994[10])进行测定;采用GB/T 20806—2006[11]的方法测定中性洗涤纤维(NDF)含量;使用NY/T 1459—2007[12]的方法测定酸性洗涤纤维(ADF)含量;钙(Ca)含量的测定采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002[13]);磷(P)含量的测定采用分光光度法(GB/T 6437—2002[14])。
1.3.4 尿样的采集与测定尿样的采集分别在预试期的第1~3天、正试期的第28~30天、正试期的第58~60天,参考朱雯[15]的点收尿法,采样时使用人工接尿结合膀胱取尿的方式进行采集,使用颈夹将牛固定,把导尿管插到膀胱中依次采集每头牛的尿样,如果采集过程中试验牛出现自主排尿则直接接取尿液。连续收集3 d,每天收集2次尿样,2次采样间隔12 h,其中每天收集尿样的时间在前1天的基础上延后4 h,收集的尿样加入10%的H2SO4调整尿液的pH(pH<3),-20 ℃保存。使用UV-1800 PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)对尿中尿酸含量进行测定,使用DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)对尿中尿囊素含量进行测定。
1.3.5 瘤胃MCP产量的测定尿中的嘌呤衍生物(PD)主要来自瘤胃微生物嘌呤,因此通过尿中PD含量对瘤胃MCP产量进行估测[16]。尿酸与尿囊素的含量之和即为尿中PD含量。
小肠吸收的外源性嘌呤数量的计算公式:
Y=0.85X+0.385BW0.75。
式中:X为小肠吸收的外源性嘌呤数量(mmol/d);Y为尿中PD的排出量(mmol/d);0.85为牛肠道吸收的嘌呤转化为尿中PD的回收率;0.385为当牛肠道吸收嘌呤的数量为0时,尿中排出的内源PD含量;BW0.75为动物的代谢体重。
瘤胃MCP产量的计算公式为:
Y=6.25×70X/(0.83×0.116×1 000)=6.25×0.727X。
式中:Y为瘤胃MCP产量(g/d);X为小肠吸收的外源性嘌呤数量(mmol/d);70为每mmol嘌呤的含氮量(mg/mol);0.83为微生物核酸嘌呤的消化率;0.116为瘤胃微生物总氮中嘌呤氮的比例;6.25为氮换算为蛋白质的平均系数。
正试期瘤胃MCP产量为正试期第30天与正试期第60天瘤胃MCP产量的平均值。
1.3.6 氮代谢指标的测定采用福斯Kjeltec8200凯氏定氮仪(丹麦Foss公司)测定尿氮含量,采用苦味酸比色法测定尿肌酐含量[17],使用UV-1800 PC分光光度计(上海普达仪器有限公司)进行比色,测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Valadares等[17]以尿肌酐(每头牛每天1 kg体重大约排出约29 mg尿肌酐)标记测定奶牛的排尿量。
氮代谢指标计算公式:
粪氮(g/d)=日排粪量×粪中CP含量×0.16;
尿氮(g/d)=每日排尿量×尿中氮含量;
乳氮(g/d)=产奶量×乳蛋白率×0.16;
氮总排泄量(g/d)=粪氮+尿氮;
氮沉积(g/d)=食入氮-粪氮-尿氮-乳氮;
氮表观消化率(%)=[(食入氮-粪氮)/食入氮]×100。
1.4 数据处理与分析试验数据用Excel 2010软件进行数据的基本处理。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,Duncan氏法多重比较进行组间差异显著性检验,以P < 0.01和P < 0.05分别表示差异极显著和显著,结果以平均值±标准误表示。
2 结果 2.1 RPMet与RPLys不同组合对奶牛主要养分采食量的影响由表 3可以看出,与C组相比,各试验组奶牛的主要养分采食量均有所提高,但差异不显著(P>0.05)。
由表 4可以看出,与C组相比,各试验组尿中尿酸、尿囊素以及PD排出量均有所提高;在瘤胃MCP产量方面,LL、ML、HL、LM、MM、HM、LH、MH、HH组分别比C组提高了9.99%(P>0.05)、10.25%(P>0.05)、11.63%(P>0.05)、8.29%(P>0.05)、29.00%(P < 0.01)、22.06%(P < 0.01)、8.59%(P>0.05)、11.89%(P>0.05)、13.32%(P < 0.05)。
由表 5可以看出,与C组相比,各试验组奶量均有所提高;其中,LL、ML、HL、LM、MM、HM、LH、MH、HH组产奶量分别比C组提高了10.05%(P < 0.01)、16.66%(P < 0.01)、8.07%(P < 0.01)、13.14%(P < 0.01)、18.61%(P < 0.01)、9.83%(P < 0.01)、12.94%(P < 0.01)、16.13%(P < 0.01)、16.36%(P < 0.01),其中MM组提高幅度最大。
由表 6可以看出,各组乳糖率无显著差异(P>0.05);在乳脂率方面,LM、MM、HM组极显著高于C组(P < 0.01),LH、ML组显著高于C组(P < 0.05),HL、LL、MH、HH组与C组差异不显著(P>0.05);在乳蛋白率方面,MM、HL、LM、ML、HH、HM、LH组极显著高于C组(P < 0.01);在乳体细胞数方面,MH、MM、HL、LH、LM组极显著低于C组(P < 0.01),HH、LL、ML、HM组与C组差异不显著(P>0.05)。
由表 7可以看出,各试验组粪氮、尿氮及氮总排泄量均低于C组;在氮总排泄量方面,试验组均极显著低于C组(P < 0.01),其中MM组最低;在尿氮方面,LH、MM、HL、ML、HM组极显著低于C组(P < 0.01),LM、HH组显著低于C组(P < 0.05);在粪氮方面,MM组极显著低于C组(P < 0.01),LL、ML、HL组显著低于C组(P < 0.05);在氮表观消化率方面,各试验组相对于C组均有所提高,其中MM、MH、LL、HL组极显著高于C组(P < 0.01),ML、HH、LM组显著高于C组(P < 0.05);在氮沉积方面,各试验组均高于C组,其中MM、MH、HL组极显著高于C组(P < 0.01),LH、LL组显著高于C组(P < 0.05);在乳氮方面,各试验组均极显著高于C组(P < 0.01)。
牛奶的生产过程需要能量以及各种合成乳成分前体物的供应,奶牛干物质采食量(DMI)是影响产奶性能的重要因素。在本试验中,各试验组的奶牛主要养分采食量相对于C组有所提高,但差异不显著。王慧媛[18]研究表明,给肉羊添加RPMet,中、高RPMet组DMI略高于C组,但各组之间并无显著差异。Xue等[19]研究表明,利木赞杂交肉牛饲料添加RPLys对DMI并没有显著影响。本试验结果与上述试验结果一致,表明饲粮中添加RPMet与RPLys对奶牛DMI并无负面影响。
3.2 RPMet与RPLys不同组合对奶牛瘤胃MCP产量的影响瘤胃MCP提供了小肠氨基酸总量的60%~85%。MCP产量的高低对于奶牛生产性能的发挥及正常体况的维持具有重要意义,并且也反映了瘤胃微生物菌群数量、活性。尿中PD主要来源于十二指肠所吸收的微生物的嘌呤代谢终产物,与瘤胃MCP产量具有高度的相关性[16]。本试验通过PD对瘤胃MCP产量进行了间接测定。在本试验中,各试验组瘤胃MCP产量方面相比于C组均有所提高,并大体呈现出RPLys为中添加水平时较好,依次为高添加水平组、低水平添加组;RPMet则明显呈现出中添加水平组、高添加水平组优于低添加水平组。张成喜等[6]研究表明,奶牛饲粮中添加RPMet的试验组瘤胃MCP产量极显著高与对照组。林英庭等[20]使用装有瘤胃瘘管的小尾寒羊研究发现,饲粮中添加RPMet与RPLys可以极显著的提高瘤胃MCP产量,与本试验结果一致。饲粮中添加的RPMet与RPLys在瘤胃中并不能完全通过,会有部分蛋氨酸、赖氨酸在瘤胃中释放,蛋氨酸与赖氨酸是瘤胃微生物生长主要限制性氨基酸中的2种氨基酸[21-23],释放出的蛋氨酸与赖氨酸可以满足部分瘤胃微生物的营养需要,促进瘤胃微生物的生长,增加瘤胃MCP产量。刘文杰等[24]在装有瘤胃瘘管的小尾寒羊饲粮中添加赖氨酸,试验组瘤胃细菌总数提高了23.9%,差异极显著。马婷婷[25]在泌乳奶牛饲粮中添加0.15%的N-羟甲基蛋氨酸钙,促进了瘤胃内主要纤维分解菌的生长繁殖。本试验中,相比于C组,试验组MCP产量均有所增加,与上述试验结论一致,说明添加PRLys和RPMet确实可以促进瘤胃内微生物的生长繁殖。
3.3 RPMet与RPLys不同组合对奶牛产奶量的影响产奶量是奶牛生产性能的重要指标。在本试验中,各试验组产奶量均极显著高于C组。其中除HH组外,RPMet中添加水平组产奶量最高,然后依次为低添加水平组和高添加水平组。在RPLys添加水平相同时,RPLys中添加量水平组产奶量最高,优于高添加水平组和低添加水平组,在各试验组中以MM组最优,产奶量提高了18.61%。张成喜等[6]在饲粮中添加RPMet,泌乳牛产奶量最高提高了13.32%,差异极显著。Robinso等[26]研究表明,饲粮中添加RPLys可提高泌乳牛的产奶量。陈傲东等[27]在饲粮中同时添加RPMet与RPLys,标准乳产量提高了2.56%。赖氨酸与蛋氨酸为泌乳牛的第一、二限制性氨基酸,饲粮中添加过瘤胃氨基酸可以增加血浆中必需氨基酸含量[28],为泌乳活动提供了更丰富的氨基酸,用于蛋白质的从头合成,进而提高产奶量。此外部分在瘤胃中溢出的蛋氨酸、赖氨酸促进了瘤胃内微生物的生长繁殖[24, 29-30],提高了瘤胃内营养物质的分解效率,使总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度以及瘤胃MCP产量增加[20, 24-25]。TVFA浓度提高为泌乳活动提供充足的能量,MCP产量增加使得皱胃与小肠部分的可消化蛋白(IDCP)含量增加,为泌乳活动提供了更多的前体物质,促进了奶牛产奶量的提高。
3.4 RPMet与RPLys不同组合对奶牛乳成分含量的影响乳蛋白率、乳脂率以及乳体细胞数是反映牛奶品质的重要指标。在本试验中,与C组相比,试验组的乳脂率、乳蛋白率均有所提高。在RPMet与RPLys不同组合中,乳蛋白率方面以RPLys中添加水平组较好,依次为低添加水平组和高添加水平组,RPMet未表现出明显趋势,其中以MM组最优;乳脂率方面以RPLys中添加水平组效果最优,其次为低添加水平组和高添加水平组;RPMet规律不明显。林英庭等[31]研究表明,饲粮中添加过瘤胃氨基酸高能复合物可以提高乳脂率以及乳蛋白率。红敏等[32]研究表明,在不同养殖模式下添加RPLys均可以提高乳脂率。张成喜等[7]研究发现,饲粮中添加RPMet(25 g/d)可显著提高奶牛乳蛋白率、乳脂率。杨正德等[33]研究发现,在泌乳盛期的奶牛中组合添加RPMet(8 g/d)与RPLys(32 g/d)可显著提高乳蛋白产量。
乳蛋白中最主要的为酪蛋白,酪蛋白中含量最高氨基酸是蛋氨酸和赖氨酸[34]。蛋氨酸、赖氨酸作为排名前2位的限制性氨基酸,饲喂RPMet与RPLys可以减少氨基酸在瘤胃内的消耗,使更多的蛋氨酸、赖氨酸在小肠部位进行消化吸收,改善小肠IDCP的氨基酸组成[33, 35],提高消化道氨基酸平衡性,提高血液当中氨基酸浓度以及进入乳腺的氨基酸浓度[28],为乳腺中蛋白质的从头合成提供了充足的前体物质,尤其是主要限制性氨基酸,进而提高了乳中蛋白质含量。并且部分在瘤胃中溢出的蛋氨酸、赖氨酸刺激了瘤胃细菌、原虫等的生长,促进了瘤胃MCP的合成,使得进入小肠中的IDCP含量增加,此外瘤胃内微生物活动的增强提高了瘤胃内NDF、ADF等物质的消化率,瘤胃内TVFA浓度增加[20, 24],其中的乙酸、丙酸关系到反刍动物能量的供应,丁酸等异位酸可用于长链脂肪酸的合成,增加的瘤胃MCP和TVFA为泌乳活动提供了更多的能量与前提物质,促进了乳蛋白与乳脂的合成。此外赖氨酸在体内一系列酶的作用下最终转化为肉碱,肉碱可以将体内脂肪酸转运至线粒体进行脂肪酸的β-氧化,为蛋白质的合成提供碳架以及部分能量[36]。蛋氨酸可以为胆碱、核酸等甲基化合物的合成提供活性甲基,而胆碱是合成乳脂的限制性营养物质[37],补充蛋氨酸对于乳脂率的提高有积极的作用。此外,RPMet与RPLys的包被材料存在一定的过瘤胃脂肪,增加了小肠内脂肪,为乳脂合成提供部分原料。
乳体细胞数是乳成分中重要的指标,不仅可以反映乳品质,而且还可以反映出牛只乳房健康以及机体免疫水平。乳体细胞数越低则说明牛只乳房越健康,乳房炎的概率越低。在本试验中,试验组相比于C组乳体细胞数有降低的趋势,其中有5个组达到了极显著的水平;并且大体呈现出RPMet为中间添加水平效果较好,低添加水平效果次之;RPLys则大体呈现出中添加水平、高添加水平时效果较好。乳体细胞数减少原因可能是因为蛋氨酸和赖氨酸在机体免疫应答过程中具有其特殊的作用,补充蛋氨酸和赖氨酸可以增强动物的免疫力。蛋氨酸缺乏会引起动物胸腺退化,降低淋巴细胞对促细胞分裂素的反应[27, 38]。Soder等[39]在奶牛饲粮中补饲RPMet后提高了奶牛外周血液T淋巴细胞的增殖能力。Chen等[40]研究发现,鸡饲粮中赖氨酸缺乏会降低体内细胞介导的免疫应答反应,减少抗体的产生。本试验中,与C组相比,HL、LM、LH、MM和MH组乳体细胞数极显著降低,呈现出一定的规律性,说明通过添加过瘤胃氨基酸满足了奶牛对于赖氨酸、蛋氨酸的部分营养需要,提高了机体免疫功能,维持了乳房健康,降低了乳体细胞数。而关于补充RPMet和RPLys具体是怎样改善奶牛机体免疫系统和降低乳体细胞数的,还需进一步研究。
3.5 RPMet与RPLys不同组合对奶牛氮表观消化率及氮排泄的影响降低氮排泄和提高氮表观消化率对于提高蛋白质资源利用率、减少环境污染有极其重要意义。在本试验中,各试验组氮总排泄量均极显著低于C组,氮表观消化率方面除LH、MH组外均达到了差异显著水平,其中MM组各方面表现最优。蛋氨酸、赖氨酸作为第一、二限制性氨基酸,其含量多少会影响其他种类氨基酸以及含氮物质的利用效率。通过饲喂RPMet、RPLys改善IDCP的氨基酸组成使更多的氨基酸参与到乳蛋白的合成中[33, 35],在本试验中试验组的乳蛋白含量也确实得到了提高,IDCP的氨基酸平衡使得经鸟氨酸循环转化为尿素过程中的氨基酸减少,减少了尿液中氮的排出,使氮更多地流向产品。本试验中,试验组相比于C组氮沉积均增加。栾玉静等[41]在带有瘘管的肉牛饲粮中添加RPLys,发现添加15 g/(d·头)RPLys可以增加肉牛日增重和沉积氮。姜淑贞[42]研究发现,肉牛饲粮中添加RPMet可以显著增加肉牛氮沉积,与本试验结果一致。氮沉积增加表明添加RPLys和RPMet提高了氮的利用效率,减少了氮的浪费。此外瘤胃内氨态氮(NH3-N)的损失也是氮素排放以及蛋白质利用率低的重要原因,饲粮中添加的RPMet和RPLys会在瘤胃内有部分溢出,溢出的蛋氨酸、赖氨酸改善了瘤胃内的营养环境,满足了瘤胃微生物部分营养需要,刺激了瘤胃内微生物的生长繁殖,瘤胃MCP产量增加,对于瘤胃内NH3-N的利用增加[29, 43],将氮转化为生物学价值更高的MCP,提高了氮的利用效率,减少了氮的损失,对于降低氮排泄具有积极影响。
4 结论奶牛饲粮中组合添加RPMet和RPLys可以提高奶牛的瘤胃MCP产量,提高产奶量、乳脂率、乳蛋白含量,降低乳体细胞数,降低氮排泄。综合考虑上述指标,在本试验条件下,以25.0 g/(d·头)RPMet+30.0 g/(d·头)RPLys为最佳组合。
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