仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)是我国海参种类中营养价值最高、深受消费者喜爱的品种。近几年，随着养殖规模的不断拓展，仿刺参养殖产业也面临着严峻的考验，尤其是养殖环境恶化、病害频发、药物残留等问题，已成为制约产业健康持续发展的重要因素^[1-2]。因此，越来越多的科研工作者以及从业者在养殖中尝试使用微生态制剂，以改善养殖生态环境，提高动物免疫力，减少病害的发生^[3]。

微生态制剂是用于改善水质、防治水产动物疾病和促进水产动物快速生长的有益微生物，以天然、无副作用、无残留等优点成为抗生素最有潜力的替代品^[4]。由于微生态制剂种类繁多，并且缺乏规范的使用方式，普遍存在使用方法和施用剂量不明确、不准确等问题，不同程度地影响了微生态制剂的使用效果。目前研究的热点主要在微生态制剂的安全性、作为饲料添加剂的应用效果、养殖环境修复及水质调控等方面^[3-6]。微生态制剂作为饲料添加剂时多随饲料直接添加到水体中，在已开展的试验研究和生产上证明具有良好的应用效果^[7-9]，但有关微生态制剂不同投喂方式及过量投喂对仿刺参养殖的影响鲜有系统的研究报道。近年来，以芽孢杆菌和乳酸菌为主的微生态制剂在改善水质和提高饲料效率等方面的效果越来越受到关注。本试验利用以芽孢杆菌和乳酸菌为主的微生态制剂，经与饲料混合放置一定时间后投喂仿刺参，研究其对仿刺参生长、消化和免疫功能的影响，以期为正确使用微生态制剂和科学配制饲料，提高刺参养殖的经济和生态效益，推进仿刺参养殖业高效健康、绿色可持续发展提供可靠的基础数据和理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用仿刺参为青岛国家海洋科研中心山东省海洋生物研究院鳌山基地选育的“鲁海1号”健康苗种，平均体重为(15.36±0.19) g。

试验用微生态制剂是市售的在生产中常用的液态复合菌种，主要成分是芽孢杆菌和乳酸菌，同时含有链球菌、硝化菌、酵母菌等，活菌数为1.0×10⁹ CFU/mL。

1.2 试验方法 1.2.1 试验设计与日常管理

仿刺参饲养用配合饲料购自青岛朗格生物技术有限公司，该产品的营养成分含量如下：粗蛋白质16.0%、粗脂肪5.0%、粗纤维8.0%、总磷6.0%、粗灰分25.0%、赖氨酸0.8%、水分10.0%。在该商品配合饲料中分别添加不同量的微生态制剂，经充分均匀混合放置9~12 h后再投喂。参考产品说明，设计4个微生态制剂添加量，分别为10、20、30和40 mL/kg。以单独投喂商品配合饲料作为对照组。投饵量为仿刺参总重的3%~5%，同时按饲料与干海泥重量比为1 : 3的比例搭配干海泥混合投喂。

试验用仿刺参饲养在25 L的塑料箱中，每箱中放置仿刺参10头，每种饲料投喂3箱仿刺参，每天16:00投喂饲料l次。养殖海水盐度为31.2±0.4，水温为15.4~18.2 ℃，pH为7.8~8.3，溶解氧(DO)浓度≥5.6 mg/L，24 h连续微量充气，每天全量换水1次。养殖试验自2018年4月4日开始，持续进行30 d。

1.2.2 仿刺参生长和摄食指标的测定

试验开始前称量仿刺参体重，作为初始体重，试验结束时再次称量其体重，作为终末体重。称重时，先将仿刺参取出，吸干体表水分后再称量。试验期间观测并记录仿刺参吐脏、存活情况，记录饲料消耗情况。各项指标计算方法如下：

式中:W₀为仿刺参初始体重(g)；W_t为仿刺参终末体重(g)；t为试验持续的时间(d)；N₀为仿刺参试验初始个体数；N_t为仿刺参试验终末存活个体数；N_e为仿刺参排脏个体数；F为饲料总摄入量(g)。

1.2.3 仿刺参消化道中消化酶活性的测定

试验结束后每组取仿刺参3头，置于灭菌玻璃培养皿中，沿腹部剪开，取出消化道，剔除呼吸树，用超纯水冲洗干净后置于玻璃匀浆器中，加入10倍体积预冷的生理盐水，经4 ℃、1 000 r/min离心15 min，取上清液，分装后保存在-80 ℃冰箱内待测。

蛋白酶活性测定采用钼酸铵法，蛋白酶活性单位定义为：每毫克组织蛋白质37 ℃条件下，每分钟分解蛋白质生成1 μg氨基酸相当于1个酶活性单位。脂肪酶活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，脂肪酶活性单位定义为：在37 ℃条件下，每克组织蛋白质在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个酶活性单位。淀粉酶活性测定采用比浊法，淀粉酶活性定义为：每毫克组织蛋白质在37 ℃条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活性单位。蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。

1.2.4 仿刺参体腔液中非特异性免疫酶活性的测定

仿刺参体腔液的采集参考胡炜等^[10]的方法并做改进。具体方法如下：每组取仿刺参3头，置于灭菌玻璃培养皿中，在仿刺参腹部切口1 cm，用灭菌枪头收集仿刺参体腔液，同组内仿刺参体腔液混匀后，经4 ℃、1 000 r/min离心10 min，取上清液，分装后保存在-80 ℃冰箱内待测。

总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，以1 mL体腔上清液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活性单位；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用钼酸铵法，以1 mL体腔上清液每秒分解1 μmol的过氧化氢(H₂O₂)的量为1个活性单位；溶菌酶(LZM)含量测定采用比浊法，1 μg/mL相当于80 U/mL。T-SOD、CAT和LZM活性均采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定。

1.3 数据处理

试验数据经Excel 2007软件进行整理后，采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，以P < 0.05作为差异显著性的标志。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析 2.1 微生态制剂对仿刺参生长和摄食指标的影响

饲料中添加不同量微生态制剂对仿刺参生长和摄食指标的影响如表 1所示。饲料中添加10、20、30和40 mL/kg微生态制剂后，与对照组相比，仿刺参的SGR和WGR均有显著增加(P < 0.05)，并且存活率均可达到100%。试验中观察发现，当饲料中微生态制剂的添加量为10、20 mL/kg时，仿刺参均能正常活动、摄食、生长，未表现出异常状况，并且仿刺参SGR和WGR随着微生态制剂添加量的增加而升高，当添加量为20 mL/kg时，SGR和WGR均达到最高，分别为1.05%/d和36.99%；当微生态制剂添加量增加到30和40 mL/kg时，发现有仿刺参个体出现排脏现象，吐脏率分别为13.33%、26.67%，仿刺参SGR和WGR随着微生态制剂添加量的增加而呈现逐渐降低的趋势。

当饲料中微生态制剂的添加量为10、20 mL/kg时，仿刺参的FCR和FR均随着微生态制剂添加量的增加而增加，以添加量为20 mL/kg时FCR和FR最高，分别为44.02%、2.36%；当饲料中微生态制剂的添加量超过30 mL/kg时，仿刺参的FCR和FR呈现下降的趋势，但微生态制剂添加量为40 mL/kg的试验组仿刺参的FR与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.2 微生态制剂对仿刺参消化道中消化酶活性的影响

饲料中添加不同量微生态制剂对仿刺参消化道中消化酶活性的影响如表 2所示。至试验结束时，仿刺参消化道中蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性均随着微生态制剂添加量的增加呈现先升高后降低的变化规律。与对照组相比，饲料中添加微生态制剂的4个试验组仿刺参消化道中蛋白酶活性均显著提高(P < 0.05)，以添加量为20 mL/kg时最高，为(11.56±0.33) U/mg prot；微生态制剂添加量为20和30 mL/kg的试验组消化道中脂肪酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，以添加量为20 mL/kg时最高，达(4.68±0.17) U/mg prot，而微生态制剂添加量为10、40 mL/kg的试验组与对照组则无显著差异(P>0.05)；仿刺参消化道中淀粉酶活性在添加量为30 mL/kg时达到最高，为(2.32±0.05) U/mg prot，显著高于对照组(P < 0.05)，其余试验组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

2.3 微生态制剂对仿刺参体腔液中非特异性免疫酶活性的影响

饲料中添加不同量微生态制剂对仿刺参体腔液中非特异性免疫酶活性的影响如表 3所示。饲料中添加微生态制剂的4个试验组仿刺参体腔液中非特异性免疫酶活性均显著高于对照组(P < 0.05)。仿刺参体腔液中T-SOD、CAT活性随着微生态制剂添加量的增加而逐渐升高，其中以添加量为40 mL/kg时最高，T-SOD和CAT活性分别为(107.27±0.14) U/mL、(21.02±0.24) U/mL，分别为对照组的1.15倍、1.36倍；仿刺参体腔液中LZM活性随着微生态制剂添加量的增加呈现先升高后降低的变化趋势，在添加量为30 mL/kg时达到最高，为(20.24±0.13) U/mL。

3 讨论 3.1 微生态制剂对仿刺参生长和消化的影响

微生态制剂含有大量的益生菌，益生菌自身不但营养价值高，富含丰富的蛋白质，而且其代谢物富含消化酶、维生素、促生长因子及多种必需的氨基酸和脂肪酸等物质^[11]。配合饲料中加入益生菌后，不仅增加了饲料的营养成分，而且能够产生易被水产动物摄食、消化和吸收的小分子物质，增强了饲料适口性并提高饲料消化率^[12]，目前在鱼类、仿刺参等水产动物养殖中也逐渐成为研究的关注点^[13-14]。复合微生态制剂各菌株通过功能上的协同互补，其作用比单一菌种更明显，众多研究表明，复合菌种相对于单一菌种具有更好的稳定性^[15]，对水产动物促生长的效果更优^[16-17]。本试验所用微生态制剂以芽孢杆菌、乳酸菌为主，同时含有硝化菌、酵母菌等多种益生菌。芽孢杆菌具有抗逆性强、产酶丰富及代谢物可提高水产动物免疫力等优点，而乳酸菌产生的抗菌物质具有抑制病原菌的作用，能够显著提高水产动物的免疫力^[18-20]。

本试验中，饲料中添加适量的微生态制剂能够显著促进仿刺参的生长，尤以当微生态制剂添加量为20 mL/kg时，仿刺参各项生长指标和消化酶活性均显著提高，但如果过量投喂微生态制剂则会对仿刺参造成一定的负面效应。分析认为，将微生态制剂与饲料混合均匀后放置9~12 h后再投喂仿刺参，饲料在微生态制剂的作用下经过一定程度的发酵活化，使饲料中的大分子物质被分解为更容易吸收的活性肽、氨基酸等小分子物质，而且复合菌种及其代谢物提高了饲料的营养价值，为仿刺参的生长发育提供了全面的营养物质和大量的外源消化酶，并最大程度地激活了仿刺参的消化酶活性，同时乳酸菌的加入还改善了饲料原有的风味，有诱食的效果^[21]，有效地促进了仿刺参对饲料的摄食、消化和吸收，提高了饲料的利用率，从而促进了仿刺参的摄食与生长，这一研究结果与李君华等^[16]、阳钢^[22]的研究结果相一致。

研究表明，微生态制剂的添加量并非越多越好，消化酶活性随着活菌量的增加而上升到一定程度后便维持在相当水平^[22]，本试验结果也有相同的规律，其中，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性随着微生态制剂添加量的增加均存在先上升后下降的变化趋势，且蛋白酶和脂肪酶、淀粉酶的活性峰值分别出现在添加量为20、20、30 mL/kg时。此外，当微生态制剂添加量超过30 mL/kg时，个别仿刺参个体出现排脏现象，而且各项生长指标呈现逐渐下降的趋势，微生态制剂的有益效果呈现逐渐减弱的趋势。分析原因认为，可能是过多的外源菌加入导致刺参肠道内菌群比例失调，动态平衡被破坏，机体产生了应激反应。因此，出现个别仿刺参表现出不适状态，不同程度地影响了摄食和消化吸收的效果，使得生长性能呈现逐渐下降的趋势。这一试验结果在微生态制剂作为仿刺参饲料添加剂的研究中尚未见相关研究报道。

3.2 微生态制剂对仿刺参免疫功能的影响

动物肠道中的有益菌群可刺激免疫细胞的分化，激活免疫系统，从而提高宿主机体免疫力^[23]。仿刺参属无脊椎动物，缺乏脊椎动物所具有的获得性免疫，主要依靠非特异性免疫对外部刺激进行防御^[24]，各种生物活性分子以及各种具有免疫活性的酶类，在抵抗外界病原的过程中发挥着巨大作用。SOD和CAT是生物体内清除活性氧自由基，使细胞免受氧化伤害的主要抗氧化酶，在防御机体衰老和生物分子损伤等方面有着极为重要的作用^[25]。LZM是一种碱性蛋白，能够破坏和清除侵入体内的异物，能担负起机体防御的机能，是非特异性免疫系统的重要成员^[26]。研究表明，饲料中添加芽孢杆菌、乳酸菌能提高水产动物的免疫力^[20]。本研究表明，仿刺参体腔液中T-SOD和CAT活性随着微生态制剂添加量的增加而升高，对仿刺参具有免疫刺激效果，这与刘姣等^[27]的研究结果一致。一般认为，益生菌剂量过高或持续时间过长都有可能引起非特异性免疫系统的持续反应而形成免疫抑制^[28]。而当微生态制剂添加量超过30 mL/kg时，仿刺参体腔液中LZM活性开始下降，说明过多的外源菌加入可能导致机体产生免疫抑制，引起仿刺参的应激反应。

益生菌的使用剂量、使用方法等是影响其功效的关键因素^[29]，相较于直接将其投入水中，通过饲料摄入是微生态制剂使用方法中最为实用、效果更好的方式。动物肠道中的细菌构成了肠道的屏障之一，对外界细菌有明显的拮抗作用，有益菌进入动物肠道后，在肠道上定植生长，并且竞争性的排斥或抑制原肠道的菌群。正常条件下，水产动物肠道内的细菌种类和数量处于动态平衡中，环境恶化、感染疾病、密度过大等因素会破坏这种平衡，使病原菌或条件致病菌异常增殖，从而使养殖对象表现出病理状态，生长性能下降^[30]。因此，在仿刺参养殖过程中微生态制剂的使用不仅要注意剂量和浓度，更要进一步明确有益菌的最佳配比，使微生态制剂充分发挥其功能和作用，以达到促进仿刺参生长，提高饲料转化率，激活免疫能力的效果，从而防止或减少疾病的发生。

4 结论

当饲料中微生态制剂添加量不超过30 mL/kg时，可有效促进仿刺参的生长和消化，提高仿刺参的免疫功能。