, 2. 广州英赛特生物技术有限公司, 广州 510663
2. Guangzhou Yingsaite Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510663, China
家禽所需的营养物质主要在消化道消化吸收[1]，以满足家禽的维持需要和生产需要。饲粮营养物质消化吸收率的高低与消化道环境条件密切相关。不同于其他单胃动物，家禽肠道结构特殊，饲粮在肠胃的停留时间较短，影响饲粮中营养物质的吸收利用水平，从而降低生长性能。可通过饲粮手段，减慢饲粮在消化系统的排空速度，促进消化吸收，从而改善生长性能和肠道健康。酸化剂是理想抗生素替代品之一，具有调节肠道菌群结构、提高肠道消化酶活性、促进肠道黏膜修复和生长等作用[2]。苯甲酸是结构较简单的一种有机酸，具有广谱抗菌[3]、低生物利用率[4]和防腐保鲜[5]的特性；有研究表明，苯甲酸能提高肉鸡生长性能和饲料转化率[6-8]，但也有研究表明，添加苯甲酸降低了肉鸡生长性能[9-12]。目前国内关于苯甲酸对肉鸡生长性能和肠道健康的研究报道还很少。因此，本试验旨在探讨苯甲酸对肉鸡生长性能、肠道形态及盲肠微生物的影响，为其在生产实践中合理使用提供重要依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料苯甲酸由广州英赛特生物技术有限公司生产并提供，纯度≥70%。
1.2 试验设计试验采用单因素设计，选取360只1日龄的罗斯308(Ross 308)白羽肉鸡，随机分为3组，每组6个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加0.07%和0.14%苯甲酸(替代等量玉米)。试验期为21 d。
1.3 基础饲粮试验采用玉米-豆粕型饲粮，参照NRC(1994)和NY/T 33—2004肉仔鸡营养需要并结合生产实践配制；饲粮形态为颗粒型，颗粒直径为2.0 mm。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在四川农业大学动物营养研究所试验场进行。试验肉鸡均采用地面平养(宽1 m×长2 m)，以谷壳为垫料。试验前清洗圈舍、料盘、料桶和饮水设备，铺垫料，然后用福尔马林和高锰酸钾(每立方米加30 mL福尔马林和15 g高锰酸钾)对其熏蒸48 h，开窗通风5 d后开始正式试验。入雏前24 h将鸡舍升温至32~35 ℃，此后温度每周降低2~3 ℃，直至保持在22~24 ℃为止。采用连续光照、自然通风、自由采食和饮水、少喂勤添的饲养管理方式。定期打扫圈舍卫生，常规免疫。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 生长性能在试验第22天提前12 h断料，以重复为单位称量肉鸡体重和余料重，计算阶段平均增重(AWG)、平均采食量(AFI)和料重比(F/G)。
1.5.2 肠道形态在试验第22天，从每个重复选择1只接近平均体重的鸡进行屠宰。屠宰后，分离空肠，取空肠中段1 cm，固定于4%的多聚甲醛溶液。将固定于4%多聚甲醛溶液中的空肠组织取出，经修整、乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋进行切片，切片厚度调整到5 μm，然后用苏木精-伊红(HE)染色，再用中性树胶加盖玻片封片，最后在光学显微镜下进行观察，每个样品均选择8个典型的视野(绒毛完整、走向平直)单元，用Image proPlus对绒毛高度和隐窝深度进行测量，绒隐比为绒毛高度和隐窝深度的比值。
1.5.3 空肠食糜的酶活性鸡屠宰后，分离空肠，取空肠中段食糜，-80 ℃保存待测。采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性，具体测定步骤根据试剂盒说明书进行。
1.5.4 盲肠微生物数量鸡屠宰后，分离盲肠，取盲肠食糜，-80 ℃保存待测。使用天根生物公司提供的试剂盒提取盲肠食糜微生物的总DNA，-20 ℃保存备用。根据细菌的16S rRNA基因序列设计特异性引物，使用Bio-Rad公司CFX96实时定量PCR仪，应用Taqman探针进行荧光定量PCR反应，使用天根公司的Super Real Mater Mix进行检测。大肠杆菌和乳酸杆菌10 μL反应体系，包括2×Super Realpre Mix 5 μL，上、下游引物各0.3 μL，探针0.2 μL，ddH2O 3.2 μL和DNA 1 μL。大肠杆菌PCR标准程序为95 ℃预变性15 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。乳酸杆菌PCR标准程序为95 ℃预变性15 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共50个循环。总菌20 μL反应体系，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL和DNA 2 μL。总菌PCR标准程序为95 ℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，59.5 ℃ 25 s，熔解曲线条件为65 ℃ 5 s，95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，共40个循环。以每克内容物为检测单位，通过Ct值与标准曲线计算得出每份样品所含拷贝数，结果用每克内容物中细菌的拷贝数的常用对数表示[lg(拷贝数/g)]。PCR引物及探针序列见表 2。
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表 2 PCR引物及探针序列 Table 2 Sequences of primes and probes for PCR |
试验数据采用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05表示差异显著，0.05≤P＜0.10表示有趋势。
2 结果 2.1 苯甲酸对21日龄肉鸡生长性能的影响从表 3可知，与对照组相比，添加苯甲酸对1~21日龄肉鸡的AWG有提高趋势(P=0.066)；添加0.07%苯甲酸显著提高了1~21日龄肉鸡的AFI(P < 0.05)；添加苯甲酸对1~21日龄肉鸡的F/G无显著影响(P＞0.05)。
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表 3 苯甲酸对21日龄肉鸡生长性能的影响 Table 3 Effects of benzoic acid on growth performance of broilers at 21 days of age |
从表 4可知，与对照组相比，添加苯甲酸显著提高空肠绒毛高度和绒隐比(P＜0.05)，对隐窝深度无显著影响(P＞0.05)。
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表 4 苯甲酸对21日龄肉鸡空肠肠道形态的影响 Table 4 Effects of benzoic acid on jejunum morphology of broilers at 21 days of age |
从表 5可知，与对照组相比，添加苯甲酸对21日龄肉鸡空肠酶活性无显著影响(P＞0.05)，但从数值上看，添加0.07%苯甲酸提高了空肠酶活性。
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表 5 苯甲酸对21日龄肉鸡空肠酶活性的影响 Table 5 Effects of benzoic acid on jejunum enzyme activities of broilers at 21 days of age |
从表 6可知，与对照组相比，添加苯甲酸对21日龄总菌、大肠杆菌和乳酸杆菌数量无显著影响(P＞0.05)，但从数值上看，与对照组相比，添加苯甲酸使大肠杆菌数量分别降低了3.91%和4.91%。
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表 6 苯甲酸对21日龄肉鸡盲肠微生物数量的影响 Table 6 Effects of benzoic acid on cecal microflora of broilers at 21 days of age |
苯甲酸是一种弱有机酸，现对有机酸促进动物生长性能的研究较多，但其中苯甲酸对肉鸡生长性能的研究较少，且报道结果不统一。Yousaf等[13]报道，添加0.2%包被苯甲酸有提高肉鸡的AWG和降低F/G的趋势；Giannenas等[14]研究发现，添加0.3%苯甲酸显著提高火鸡1~28日龄AWG，且显著降低F/G；Amaechi等[6]结果表明，添加1.2%苯甲酸能显著提高肉鸡生长性能，但添加1.8%和2.4%苯甲酸显著降低肉鸡生长性能。Józefiak等[10-11]研究发现，添加0.25%苯甲酸对肉鸡生长性能无显著影响，添加0.50%和0.75%苯甲酸抑制了肉鸡生长，提高了F/G；户陆女等[12]报道，添加0.6%苯甲酸显著降低了肉鸡AFI和AWG；Talebi等[9]在肉鸡饲粮中添加1%苯甲酸显著降低了AWG。本试验结果表明，在饲粮中添加苯甲酸显著提高1~21日龄肉鸡的AFI，且有提高AWG趋势，这与前人研究结果不完全一致。其原因可能与肉鸡品种、饲养季节、管理与苯甲酸添加水平等有关。21日龄肉鸡的生长性能的提高，可能是由于苯甲酸类产品具有一般较弱的促生长作用；当肉鸡在1~21日龄阶段时(敏感期)，添加苯甲酸可使肠道pH降低，当小肠内pH降低到3.5~4.0时反射性的抑制胃的排空[15]，胃排空速度会随着pH的降低而减慢，从而降低食糜黏度，增加食糜在胃中的储存时间，增加养分的溶解性，从而表现出较好的促生长效果。此外，添加苯甲酸，相比于对照组，AWG分别提高了5.92%和4.23%；AFI分别提高了5.05%和3.85%；从数据上看，添加0.07%苯甲酸对1~21日龄肉鸡生长性能有一定程度的改善效果。其原因可能是0.14%的苯甲酸添加水平超过了肉鸡机体自身对苯甲酸的耐受度；AFI的显著差异，可能是添加0.14%苯甲酸影响了饲粮的适口性。
3.2 苯甲酸对21日龄肉鸡肠道健康的影响 3.2.1 苯甲酸对21日龄肉鸡空肠肠道形态的影响肠道是机体营养物质消化吸收的主要场所[1]，空肠是营养物质吸收的重要部位，其发育状况直接影响营养代谢和生长性能[16]，完整的肠道形态结构是保证机体健康的前提[1]。目前，关于苯甲酸在畜禽肠道形态的研究主要集中在仔猪上，对家禽肠道形态的研究报道相对较少，且不一致。宋凡春[17]的研究表明，添加0.25%的苯甲酸对肉鸡肠道形态没有显著影响，添加0.5%的苯甲酸降低了绒毛高度；Giannenas等[14]发现，添加0.3%的苯甲酸对火鸡肠道形态无显著影响；苟清碧等[18]研究结果表明，添加0.5%的包被苯甲酸对肠道形态无显著影响。Giannenas等[19]报道，添加0.3%苯甲酸能显著提高肉鸡空肠绒毛高度。本试验结果表明，添加苯甲酸显著提高了21日龄肉鸡的空肠绒毛高度和绒隐比。其原因可能是添加苯甲酸，使pH下降，机体细胞分裂增加[20]，绒毛高度增加，绒隐比提高，肠壁对营养物质的吸收面积增加，进而促进了机体肠道健康。结合本试验生长性能数据分析，可能是通过肠道形态的改善，饲粮中的营养物质得到更充分的吸收等原因，实现了苯甲酸对肉鸡生长性能的改善。
3.2.2 苯甲酸对21日龄肉鸡空肠酶活性的影响已有研究表明，肠道各段消化酶活性不一，近心端和中部的消化酶活性高于远心端，且营养物质的吸收也主要在中前部[21]。目前关于酸化剂对肠道酶活性的研究报道较多。黄凯[22]研究在肉鸡饲粮中添加0.15%的苯甲酸对空肠食糜胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的作用效果低于复合酸化剂。宋凡春[17]研究表明，添加0.25%包被苯甲酸显著降低了脂肪酶和淀粉酶活性，且添加0.5%包被苯甲酸时，其胰蛋白酶活性显著降低。本试验研究结果表明，添加0.07%和0.14%的苯甲酸对空肠食糜酶活性无显著影响，与上述结果不一致，可能原因是酸化剂种类不同、苯甲酸对畜禽品种有一定的选择性、苯甲酸添加形态及水平不同等或者其他原因。
3.2.3 苯甲酸对21日龄肉鸡盲肠微生物的影响目前苯甲酸对家禽盲肠微生物的研究报道结果比较统一，苟清碧等[18]研究表明，添加0.5%包被苯甲酸可抑制盲肠有害菌增殖；Yousaf等[13]研究表明，添加0.2%包被苯甲酸可以调节肉鸡盲肠微生物菌群，增强乳酸杆菌的繁殖；宋凡春[17]研究表明，添加0.25%和0.50%包被苯甲酸显著提高了盲肠乳酸杆菌的丰度；Giannenas等[14]研究结果表明，添加0.3%和1.0%苯甲酸能显著提高火鸡盲肠食糜中乳酸杆菌数量，并降低大肠杆菌数量。但本试验结果表明，添加苯甲酸不影响盲肠食糜中的微生物，与苯甲酸降低盲肠大肠杆菌数量和增加乳酸杆菌数量研究结果[23]存在差异。差异的原因可能与动物品种、生理阶段、饲养管理、饲粮组成和苯甲酸的添加水平及添加形态有关，其主要原因可能是本试验苯甲酸的添加水平低于前期研究，而Knarreborg等[23]研究证实苯甲酸具有广谱杀菌作用，对肠道内乳酸杆菌、大肠杆菌等都有抑制作用，杀菌效果有明显的剂量依赖性。
4 结论苯甲酸能够提高肉鸡空肠绒毛高度和绒隐比，进而在一定程度上提高1~21日龄肉鸡的生长性能，但对盲肠微生物数量没有显著影响；1~21日龄肉鸡饲粮苯甲酸的添加水平以0.07%效果较好。
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