2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
围产期是指产前3周到产后3周的这一段时间[1]，为了机体适应分娩和分泌乳汁，奶牛的内分泌和代谢在这一时期会发生巨大的变化[2]。在奶牛养殖中围产期是一个既特殊又关键的时期，它的饲养管理决定了奶牛整个泌乳期的产奶量和健康状况[3]。由于干物质采食量的下降以及泌乳早期对能量需求的激增导致机体处于能量负平衡状态[4-5]。此时，奶牛出现血液中葡萄糖和胰岛素含量降低，胰高血糖素含量增加，激素敏感脂酶活性下降，机体动员体脂[6-7]，释放出游离脂肪酸(NEFA)进入循环并且转移至肝脏，导致脂肪肝等疾病发生[3]。除此之外，由于分娩应激和氧化应激，奶牛的免疫力下降，产后发病率极高，其中包括乳房炎、子宫内膜炎、产后败血症等，不利于奶牛产后生产性能和繁殖性能的发挥，严重影响奶牛养殖的经济效益[8]。为了缓解能量负平衡对动物的损害，调控围产期奶牛的营养，研究学者们进行了一系列的工作，主要方法有调整围产后期饲粮能量水平、增加饲粮脂肪水平、使用饲料添加剂等[9]。2007年，Guo等[10]将产前饲粮的能量水平提高至产后饲粮的能量水平，但是结果显示不但没有提高产后的生产性能，反而加剧了奶牛的脂质动员，更容易导致奶牛发生酮病。随后，Janovick等[11]发现降低产前饲粮能量水平可以轻微缓解奶牛围产期各种变化对奶牛生产性能的影响，但是效果不明显。近年，有报道称，瘤胃保护烟酸可以抑制脂肪分解，降低牛奶能量输出，改善转型奶牛产后能量平衡[12]，这与代谢组学得出的补充烟酰胺可以改变不饱和脂肪酸代谢、减轻氧化应激[13]的结果一致。另有研究发现，在奶牛饲粮中添加瘤胃不可降解蛋白质[14]或脂囊化共轭亚油酸[15]可以提高繁殖性能乙基纤维素包被的过瘤胃蛋氨酸可以提高奶牛的产奶量，减轻炎症和氧化应激。但是，目前缓解负能量平衡、提高产乳性能的途径还不统一，需要解决的关键是围产期的葡萄糖代谢。
葡萄糖对于奶牛合成牛奶是必不可少的[16-17]，其在小肠内摄取和吸收之后转换成能量比微生物发酵生成VFA更加有效[18]。研究发现，十二指肠注射葡萄糖的泌乳奶牛与注射等能VFA的泌乳奶牛相比，产奶量和乳蛋白含量都得到了提高[19]。因此，了解肠道内葡萄糖的吸收和代谢是维持围产期奶牛健康、提高性能和生产力的关键。葡萄糖主要是通过钠依赖转运载体——钠-葡萄糖协调转运蛋白1(SGLT1)、钠-葡萄糖协调转运蛋白3(SGLT3)和非依赖钠转运载体——葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、葡萄糖转运蛋白5(GLUT5)的主动转运进入肠上皮细胞被吸收[20-21]。肠上皮细胞与机体免疫密切相关，研究表明，围产期肠上皮细胞发生了形态学上的变化，这些变化是免疫相关基因和生长因子相互作用的结果[22]。肠道微生物区系受饲粮的影响，其同时也会影响机体对营养物质的消化吸收。研究发现，肠道黏膜先天免疫功能与微生物多样性之间有着密切的联系[23]。但是目前国内针对围产期奶牛补饲葡萄糖对肠道微生物群落及免疫和代谢相关基因表达的研究鲜有报道。因此，本试验通过给围产期奶牛补饲过瘤胃葡萄糖，研究其对围产期奶牛空肠发酵参数、微生物群落以及黏膜代谢与免疫相关基因表达的影响，以期为过瘤胃葡萄糖在围产期奶牛养殖中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计随机选择体重[(515±42) kg]相近、年龄(4~5岁)相仿的荷斯坦奶牛10头，随机分成2个组，每组5头。对照组和试验组奶牛饲喂相同的饲粮，同时对照组奶牛每头每日给予90 g过瘤胃脂肪(软脂酸)，而试验组奶牛每头每日给予200 g过瘤胃葡萄糖(用脂肪包被，90 g软脂酸+90 g葡萄糖+20 g水)。奶牛产前与产后饲粮组成及营养水平见表 1。预试期14 d(产前第21天到产前第8天)，正试期21 d(产前第7天到产后第14天)。试验期间奶牛每日喂料2次，自由采食，自由饮水，10头奶牛在正试期结束后全部屠宰。
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表 1 奶牛产前与产后饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets for dairy cows in prepartum and postpartum (DM basis) |
奶牛屠宰按照国家标准GB 12694—2016中方法进行，宰前空腹24 h后，颈部放血致死，屠宰后立即无菌操作取出空肠中段食糜，其中200 mg左右的食糜经液氮速冻后存于-80 ℃，用于肠道微生物DNA的提取及后期分析，剩下的部分取约1.5 g左右加入150 μL 25%(质量体积分数)的偏磷酸，离心(4 ℃、12 000 r/min，10 min)后取上清液，-20 ℃保存，用于测定挥发性脂肪酸含量。将肠道中内容物去除干净后，用生理盐水和磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)冲洗几次，然后用无菌的载玻片刮取2份黏膜样品，液氮速冻，存于-80 ℃用于空肠黏膜附着微生物DNA的提取和组织RNA的提取。
1.3 空肠食糜中挥发性脂肪酸含量的测定将解冻后的上清液4 ℃、12 000 r/min离心10 min，然后将上清液转移至上样瓶内，参照Wu等[24]的方法通过气相色谱仪测定空肠食糜中挥发性脂肪酸的含量，并计算总挥发性脂肪酸的含量及各组分占总挥发性脂肪酸的比例。
1.4 空肠黏膜代谢及免疫相关基因表达的测定 1.4.1 总RNA提取和cDNA的合成采用TRIzol试剂(Invitrogen公司，美国)从空肠黏膜中提取总RNA，之后用琼脂糖凝胶电泳和ND-1000超微量紫外分光光度计测定所提取的总RNA的质量和浓度。随后用TaKaRa公司的Prime-Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit，按照操作手册反转录为cDNA。将反转录产物置于-20 ℃保存备用。
1.4.2 基因表达量的定量荧光定量PCR在Lightcycler 480 Ⅱ序列检测系统(Roche公司，瑞士)中进行，按照TaKaRa定量试剂盒说明书推荐的体系和条件进行反应。反应体系为：SYBR Green Ⅰ荧光染料预混试剂5 μL，ROX 0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA模板1 μL，灭菌双蒸去离子水3.4 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s并采集荧光信号，共40个循环；按仪器操作说明选择熔解曲线分析，60 ℃升至95 ℃15 s，60 ℃15 s、95 ℃15 s，自动采集荧光。同时，每对引物均设置相应的无模板阴性对照(NTC)和无聚合酶污染对照(NAC)。以β-肌动蛋白(β-actin)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为参比基因，按照2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量，结果以差异变化(FC)表示[25]。用于黏膜基因表达的引物序列信息见表 2。
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表 2 用于基因定量的引物序列信息 Table 2 Primer sequence information used in gene quantification |
空肠食糜微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen公司，德国)。为了尽可能获得革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的总DNA同时又不影响DNA结构的完整性，将试剂盒说明书方法进行改进，将破壁温度从70 ℃上调至85 ℃进行DNA的提取。提取的DNA用1.5%凝胶电泳检测其完整性，并用ND-1000微量紫外分光光度计测定核酸浓度(ng/μL)及纯度(OD260 nm/OD280 nm)后，于-20 ℃保存备用。
1.5.2 总细菌及功能微生物的绝对定量本课题组构建了总细菌及功能微生物的质粒，对总细菌、纤维降解菌[产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)]、淀粉降解菌[反刍兽新月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)]、分解葡萄糖的细菌[普雷沃氏菌属(Prevotella)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)]及免疫相关细菌[梭菌属ⅪⅤ子集(Clostridial cluster ⅪⅤ)、乳杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)]进行绝对定量。按照焦金真等[26]的方法，运用已验证的相应的微生物的特异性引物(表 3)，分别将含有特定微生物组16S rRNA基因插入物的质粒DNA连续稀释10倍，构建标准曲线。标准曲线的斜率在-0.319 7~-0.295 9，并且相关系数(R2)均大于0.99，符合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的标准曲线要求。根据MIQE指南中微生物引物的扩增效率＝10-slope-1(slope为标准曲线的斜率)[27]，可以得到本试验中引物的扩增效率均处于95%~105%，说明引物的扩增效率较好。同时，每对引物均设置相应的NTC和NRC。然后按照拷贝数公式[拷贝数=(标准曲线Ct值得到的拷贝数×每个样品基因组DNA的浓度×提取DNA时最后溶解DNA的ddH2O的体积)/(用于qRT-PCR的DNA量×提取DNA时所称量的食糜的重量)]计算出每克食糜中总细菌及功能微生物的拷贝数，之后转换为每克食糜中总细菌或功能微生物拷贝数的对数值[lg(拷贝数/g)]进行统计分析。
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表 3 用于微生物定量的引物序列信息 Table 3 Primer sequence information used in microbe quantification |
试验数据采用R软件的Stats基础包进行统计分析。鉴于目的基因表达量和微生物拷贝数的数据不符合正态分布，因此，采用Wilcox’s rank-sum非参数检验法分析试验组与对照组在发酵参数、基因表达量及微生物拷贝数上的差异。结果以平均值和均值标准误表示，P<0.05为差异显著，0.05≤P≤0.10为差异趋于显著，P>0.10表示差异不显著。
2 结果与分析 2.1 空肠发酵参数由表 4可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖尽管在数值上降低了空肠食糜中乙酸和丁酸的比例，但是差异均没有达到显著水平(P>0.10)。然而，添加过瘤胃葡萄糖有降低空肠食糜中总挥发性脂肪酸含量的趋势(P=0.094)。
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表 4 过瘤胃葡萄糖对空肠发酵参数的影响 Table 4 Effects of rumen-protected glucose on fermentation parameters of jejunum |
由表 5可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖有上调空肠黏膜中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达量的趋势(P=0.063)，同时显著性地上调了糖异生关键酶丙酮酸羧化酶(PC)的表达量(P=0.016)；表中其他葡萄糖转运相关基因的表达量在2组间没有显著差异(P>0.10)。
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表 5 过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜葡萄糖转运相关基因表达量的影响 Table 5 Effects of rumen-protected glucose on expression levels of genes related glucose transporter in jejunal mucosa |
由表 6可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著下调了空肠黏膜中细胞因子白细胞介素-22(IL-22)的表达量(P=0.016)，并且有下调Toll样受体4(TLR4)(P=0.063)、白细胞介素-17A(IL-17A)(P=0.063)和白细胞介素-26(IL-26)(P=0.063)表达量的趋势，同时显著上调了occludin的表达量(P=0.016)；表中其他免疫相关基因的表达量不受过瘤胃葡萄糖的显著影响(P>0.10)。
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表 6 过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中免疫相关基因表达量的影响 Table 6 Effects of rumen-protected glucose on expression levels of genes related immune in jejunal mucosa |
由表 7可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著性地上调了空肠黏膜中类胰岛素生长因子结合蛋白5(IGFBP5)的表达量(P=0.032)，同时显著性地下调了基质金属蛋白酶1(MMP1)(P=0.016)和基质金属蛋白酶9(MMP9)(P=0.032)的表达量，对表中其他细胞增殖分化相关基因的表达量无显著影响(P>0.10)。
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表 7 过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中细胞增殖分化相关基因表达量的影响 Table 7 Effects of rumen-protected glucose on expression levels of genes related proliferation and differentiation in jejunal mucosa |
由表 8可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中总细菌、拟杆菌属和乳杆菌属的数量没有显著影响(P>0.10)，但显著地提高了梭菌属ⅪⅤ子集的数量(P=0.036)。
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表 8 过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中总细菌、拟杆菌属、梭菌属ⅪⅤ子集和乳杆菌属数量的影响 Table 8 Effects of rumen-protected glucose on populations of general bacteria, Bacteroides, Clostridial cluster ⅪⅤ and Lactobacillus in jejunal chyme |
由表 9可知，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌(降解纤维的产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌与主要降解淀粉的反刍兽新月形单胞菌以及分解葡萄糖的普雷沃氏菌属、栖瘤胃普雷沃氏菌)的数量没有产生显著影响(P>0.10)。
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表 9 过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌数量的影响 Table 9 Effects of rumen-protected glucose on populations of carbohydrate-degrading bacteria in jejunal chyme |
围产期时奶牛大多处于能量负平衡状态[4-8]。本试验结果中发现，在围产期添加过瘤胃葡萄糖可以降低奶牛空肠中总挥发性脂肪酸的含量，由此推测添加的过瘤胃葡萄糖在小肠中被直接吸收为奶牛供能，而减少了通过发酵供能带来的能量损耗，有效地提高了能量利用率[28-29]。研究发现围产期添加过瘤胃胆碱[30-31]和过瘤胃烟酸[32]可以显著地提高围产期奶牛的平均产奶量。另外，在围产期奶牛饲粮中添加酵母β-葡聚糖也可以提高产奶量及乳蛋白产量[33]。经十二指肠灌输葡萄糖可以提高奶牛的产奶量、乳糖含量和乳蛋白产量[19]。与之吻合的是，本课题组前期试验结果显示，添加过瘤胃葡萄糖可以提高围产期奶牛的产奶量(18.9 kg/d vs. 16.9 kg/d；P=0.01)[34]。如前所述，添加过瘤胃葡萄糖避免了瘤胃对葡萄糖的发酵，葡萄糖可到达小肠，直接作为能量供应者替代了其他转换发酵等形式，提高了能量的利用率，缓解了能量负平衡，某种意义上解释了围产期奶牛产奶量提高的原因。
葡萄糖的吸收主要依赖于小肠上皮细胞膜上的转运载体蛋白[35]。转运蛋白载体主要分为2类[20-21]：钠-葡萄糖协调转运蛋白(SGLTs)和葡萄糖转运蛋白(GLUTs)。其中GLUTs是一种可顺其浓度梯度不消耗能量地被动运输葡萄糖，且受饲粮因素的影响[18]。卢艳娟等[35]发现，将生长后期滩羊(36~40 kg)的饲粮能量及蛋白质水平提高20%，可以显著提高小肠中GLUT4的表达量。与之类似，本研究发现，添加过瘤胃葡萄糖提高了空肠中CLUT4的表达量，增强了空肠对葡萄糖的吸收和利用。姜涛[36]报道反刍动物所需葡萄糖的90%是由糖异生提供的。糖异生途径的关键酶是PC和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)，PC的表达量直接影响到肝脏糖异生的能力[37]。本试验结果显示，围产期添加过瘤胃葡萄糖可以提高空肠黏膜中PC的表达量，这表明在奶牛能量负平衡的情况下，添加过瘤胃葡萄糖可能会增加糖异生作用，以弥补由于干物质摄入不足引起的能量缺乏，从而缓解能量负平衡。
Toll样受体(TLRs)是一类在天然免疫中有重要作用的跨膜信号传递的先天模式识别受体，通过识别病原相关分子模式来迅速激活天然免疫系统[38]，进而诱导炎症因子的表达来参与炎症反应[39]。其中，TLR4是机体固有免疫和获得性免疫的桥梁。余盼等[40]发现，TLR4在患有乳房炎的奶牛的乳腺组织中的表达量较正常奶牛高，进而引起其下游的细胞因子mRNA表达量显著升高。围产期由于存在多种应激，机体发生免疫抑制，多种免疫细胞功能发生改变[2, 6-7]，机体的免疫力下降。柒启恩等[41]的研究表明，围产期母猪饲粮中添加壳寡糖能显著性地提高母体和子代的免疫力，提高子代的存活率。本研究结果显示，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖下调了空肠黏膜中TLR4的表达量和促炎性细胞因子IL-17A、IL-22、IL-26的表达量；与此同时，具有屏障功能的连接蛋白occludin的表达量有所上调。这意味着添加过瘤胃葡萄糖可以提高肠道的屏障功能，防止细菌等有害物质进入[23]。由此推断，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖有可能通过介导炎症反应相关通路基因的表达，改变肠道屏障功能，增强围产期奶牛空肠的免疫应答能力。
胰岛素样生长因子(IGFs)在细胞分化和增殖过程中发挥重要作用[40]。胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBPs)是参与协助IGFs的结合能力的主要蛋白，其中IGFBP5是IGFBPs家族中最保守的成员，对IGFs信号具有重要的调节作用。研究表明，瘤胃上皮中IGFBP5的表达量与乳头宽度呈显著正相关，通过促进其形态学发育来促进乳头的增长[42]。景小平[43]研究表明，冬季给藏绵阳添加精料补充料，瘤胃乳头中IGFBP5的表达量显著升高，从而促进了瘤胃组织形态的发育。鉴于IGFBP5表达量的升高预示着细胞分化及增殖能力的提升，其在添加过瘤胃葡萄糖组的升高可以表征肠道组织形态的改善及代谢功能的增强。基质金属蛋白酶(MMPs)是由多种基质细胞、炎症细胞等产生的高度保守的一类酶，其中，MMP9是参与创面的修复和愈合过程中角质形成细胞从基底膜脱离、促进细胞沿创面基质爬行、纤维蛋白-纤维连接蛋白基质的再塑形的重要调节蛋白[44]，而MMP1在星状细胞中能够促进细胞外基质的降解和纤维化的逆转[45]。Wathes等[46]研究表明，MMPs在子宫内膜破裂中起着重要作用。另外，李云涛等[47]报道，MMP9的表达量与创面愈合率呈负相关。本研究中，添加过瘤胃葡萄糖下调了空肠黏膜中MMP1和MMP9的表达量可以预示肠道细胞损伤的修复。
饲粮是影响胃肠道微生物群的重要因素之一[48]。例如，在幼羊饲粮中添加大黄有利于回肠黏膜梭状芽胞杆菌、乳酸菌和假单胞菌的定植[23]。婴幼儿期肠道菌群定植发生在出生之前，大约3个月后就趋于稳定，其肠道微生物对机体成年期新陈代谢以及后代的免疫系统均有影响[49]。梭菌是肠道一大类兼性厌氧微生物，与许多疾病息息相关。有益的梭菌属包括酪酸梭菌、普拉梭菌等，它们维持肠道厌氧，保护肠黏膜屏障，防治腹泻的发生。有害的梭菌属包括艰难梭菌和产气荚膜梭菌等，它们发酵能力强，产酸产气，损伤细胞膜，导致细胞损伤，引起肠道炎症并导致腹泻[50]。有研究证实，梭菌属ⅪⅤ子集属于拉氏螺旋体科，它的丰富度与患炎症性肠炎的概率呈负相关[51-52]。本研究结果显示，与对照组相比，添加过瘤胃葡萄糖显著提高了空肠食糜中梭菌属ⅪⅤ子集的数量，却未限制影响其他的功能微生物的数量。由此推测，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖有可能通过促进免疫相关有益菌梭菌属ⅪⅤ子集的定植，从而抑制肠道的炎症反应，降低患炎症性肠炎的发生率。
4 结论围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖可以降低空肠食糜中总挥发性脂肪酸的含量，上调与葡萄糖转运、糖异生、细胞代谢相关基因的表达，促进免疫有益菌梭菌属ⅪⅤ子集的定植，在缓解炎症反应的同时提高黏膜屏障功能。过瘤胃葡萄糖可以作为一种有效的饲料添加剂用于缓解奶牛围产期的能量负平衡状态。
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