抗生素在养殖业中如同一把“双刃刀”，一方面提高动物生产力，另一方面却在动物体内造成药物残留和耐药性，导致超级细菌产生^[1]。我国养殖行业的当务之急是寻找和研发抗生素类药物饲料添加剂的替代品。在众多替抗产品中，微生态制剂是目前市场广泛应用的替抗产品之一，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)、地衣芽孢杆菌等，该类产品不仅有耐高温、高压，抗逆性强等特点^[2]，还具有分泌多种活性较强能降解某些抗营养因子的酶类^[3]、改善畜禽生产性能^[4]、增强免疫力^[5]、减少肠道内致病菌数量及维持菌群平衡^[6]等多种作用。目前，BS在猪生产中的研究主要集中在改善仔猪生产性能和防治腹泻等方面，而关于BS对肥育猪生长性能和理化因子的影响及机理研究鲜有报道。因此，本试验以生长后期的肥育猪为研究对象，探讨饲粮中添加BS对肥育猪血浆生化和免疫指标及粪便菌群的影响，为BS在猪生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理

饲养试验于湖南省某科研猪场进行。选取120头平均体重为(62.90±2.37) kg的“杜×长×大”三元杂交肥育猪，公母各占1/2，随机分为3个组，每组5个重复，每个重复8头猪。对照组(A组)饲喂基础饲粮，试验组(B、C组)分别在基础饲粮中添加100和200 mg/kg BS。预试期7 d，正试期63 d。试验用基础饲粮参考NRC(2012)猪营养需要配制，其组成及营养水平见表 1。所选试验猪均按照猪场的常规免疫程序进行疫苗接种，其中21日龄猪接种圆环疫苗，28日龄猪接种猪瘟疫苗(4周后2次免疫)。试验期间饲养管理按常规进行，自由采食和饮水，每周进行1次喷雾消毒，保持猪舍通风。

1.2 试验材料

试验用BS为上海牧冠企业有限公司提供的稀释制剂，活菌数≥1×10⁹ CFU/g。

1.3 样品采集

试验结束后，以重复为单位随机选取2头猪(公母各占1/2)，采血前禁食12 h，自由饮水。耳静脉采血于肝素抗凝管中，3 000 r/min离心10 min分离血浆，-20 ℃冰箱保存，用于测定血浆生化和免疫指标；取适量新鲜排泄粪样，置于10 mL高压灭菌离心管中，-80 ℃冰箱冻存，用于粪便菌群测定；试验结束时，每组随机选取6头平均体重相近的猪(公母各占1/2，每个重复至少选取1头)，共18头猪，空腹24 h后进行屠宰，宰后0.5 h内各取胸腰结合处背最长肌约100 g，-20 ℃冰箱冻存，用于肌肉内毒素含量测定。

1.4 血浆生化指标

血浆生化指标采用迈瑞生物公司生产的全自动生化分析仪及配套试剂盒测定。严格按照试剂盒说明操作，测定血浆中白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总蛋白(TP)、尿素(UREA)、总胆固醇(TCHO)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)含量及碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.5 血浆及肌肉免疫指标

采用R&D公司生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒与MB-530酶标仪测定血浆免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量、猪瘟病毒抗体(CSFV)和圆环病毒抗体(PCV)水平及血浆、肌肉中内毒素含量，肌肉测定前先制成10%的组织匀浆。

1.6 肥育猪粪便菌群相对含量的测定

每份粪便样品称取(200±10) mg置于2 mL离心管中，按照粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328，天根生化科技有限公司)说明进行DNA提取。用超微量分光光度计(NanoDrop ND-2000 UV)检测DNA浓度，按文献[7]提供的反应体系和反应程序，采用荧光定量PCR试剂盒(宝生物，大连)进行荧光定量PCR。引物采用Primers软件设计，由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表 2。采用2^-ΔΔCt法计算目的细菌的相对含量。

1.7 数据统计与分析

采用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)并以Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，用P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 BS对肥育猪血浆生化指标的影响

由表 3可知，与对照组(A组)相比，B、C组肥育猪血浆ALP活性极显著降低(P < 0.01)；B组血浆GLB含量显著降低(P < 0.05)，血浆ALB含量显著提高(P < 0.05)；各组间血浆UREA、TG、TCHO、GLU、TP含量和AST活性均无显著差异(P > 0.05)。

2.2 BS对肥育猪血浆免疫指标的影响

由表 4可知，与对照组相比，C组肥育猪血浆IgA含量和PCV水平极显著提高(P < 0.01)，各组间血浆IgG、IgM含量和CSFV水平均无显著差异(P > 0.05)。

2.3 BS对血浆和肌肉中内毒素含量的影响

由表 5可知，饲粮中添加BS对肥育猪血浆和肌肉中内毒素含量均无显著影响(P > 0.05)

2.4 BS对肥育猪粪便菌群相对含量的影响

由表 6可知，与对照组相比，B、C组粪便中双歧杆菌相对含量显著提高(P < 0.05)；B组粪便中巨大芽孢杆菌相对含量显著提高(P < 0.05)；C组粪便中产气荚膜梭菌相对含量极显著降低(P < 0.01)；试验组沙门氏菌(P=0.090)和大肠杆菌(P=0.097)的相对含量均有降低的趋势。

3 讨论 3.1 BS对肥育猪血浆生化指标的影响

畜禽血浆中ALP和AST活性是反映机体肝脏生理机能状况的重要指标。尹清强等^[10]研究报道，微生态制剂可使仔猪血清中ALP活性显著降低；Forte等^[11]研究报道，嗜酸乳杆菌和BS的混合物可降低蛋鸡血浆中AST活性；也有研究显示，在饲粮中添加BS对血清中AST和ALP的活性无显著影响^[12-13]。各学者报道的研究结果并不一致。本试验结果表明，添加BS能极显著降低肥育猪血浆ALP活性，而对AST活性却无显著影响，与以上学者研究结果不尽相同。究其原因，可能与动物品种、营养水平、BS活菌数及使用阶段不同等因素有关。

机体血浆中ALB含量的高低反映了肝脏合成蛋白质能力的强弱，UREA含量的高低反映了机体蛋白质代谢水平。本研究中，添加100 mg/kg BS显著提高血浆中ALB含量，且血浆中UREA含量较对照组有提高趋势，表明BS的添加对改善肥育猪肝脏的蛋白质合成、代谢方面具有积极作用，这与吕尊周等^[15]研究报道的结果基本一致。GLB由机体免疫器官产生，当体内存在病毒等抗原时，免疫器官会产生大量GLB消灭抗原。本试验结果表明，添加100 mg/kg BS显著降低血浆中GLB含量，且添加200 mg/kg BS与对照组相比，也有一定程度的降低趋势。说明饲粮中添加BS能增强机体免疫屏障功能，减少外来病原侵扰。需要指出的是，添加100 mg/kg BS与添加200 mg/kg BS比较，其血浆中GLB含量稍低但差异不显著，血浆中ALB含量较高且差异显著，饲粮中BS添加量少的反而明显一些，其作用和机理有待探讨及进一步的研究验证。

3.2 BS对肥育猪免疫指标的影响

机体内免疫球蛋白主要有IgM、IgG和IgA。杨锋^[15]在仔猪饲粮中添加0.3%和0.5%的BS，显著增加血清中IgG和IgA的含量。本试验结果表明，饲粮中添加200 mg/kg BS显著提高肥育猪血浆中IgA含量，而对IgG含量效果不显著。其原因可能是：IgM是免疫应答中最早产生，在抗感染早期具有重要作用^[16]。IgG的重要作用主要体现于体液免疫，可阻止相应抗原穿透黏膜进入组织中^[17]。本试验猪为生长后期的肥育猪，其机体的IgM免疫应答在早期已经建立，IgG的体液免疫已趋于稳定，因此，BS对IgG与IgM含量变化没有影响。而IgA是黏膜免疫的主要抗体，主要与非特异性免疫防护机制进行协同作用^[18]。BS作用于肠道黏膜，肠相关淋巴组织B细胞通过克隆扩增后可产生IgA^[19]。BS进入动物肠道后，通过在肠道内淋巴抗原结合位点发挥作用，促进肠道内相关淋巴组织生长，增加T、B淋巴细胞数量，使黏膜表面分泌型IgA和血浆中IgA抗体增加，从而激活机体肠道黏膜免疫防御系统，达到增强机体免疫机能^{[17, 20]}。

猪瘟和猪圆环病均可导致猪群产生免疫抑制，引起猪原发性或继发性感染。一旦患病，将严重影响猪的生长发育，给猪场效益造成巨大损失。目前关于BS对肥育猪猪瘟和圆环病毒抗体的影响研究报道甚少，但有研究结果表明BS具有提高疫苗免疫的效果^[7]。张超^[21]研究表明，复合微生态制剂(BS、嗜酸乳杆菌等)能提高断奶仔猪CSFV水平，增强机体免疫功能。Liu等^[22]研究发现，饲粮中添加BS C-3102对雪峰乌骨鸡血清中新城疫病毒抗体水平无显著影响，但随着BS C-3102添加量的增加，血清中禽流感病毒抗体水平显著升高。本研究结果与Liu等^[22]研究结果类似，在饲粮中添加100 mg/kg BS对肥育猪血浆中抗体水平影响不显著，但添加200 mg/kg BS时，可显著提高血浆中PCV水平，且在一定程度上提高了血浆中CSFV水平。其作用机制一方面可能是BS作用于淋巴抗原结合位点，促进相关淋巴组织生长，增加T、B淋巴细胞数量，增强对T细胞依赖抗原的免疫应答，提高抗体水平^[23]；另一方面可能是BS通过调节细胞因子连接保护抗原基因，形成融合蛋白，从而利于疫苗免疫抗体产生，达到提高免疫增强作用^[24]。

3.3 BS对肥育猪血浆和肌肉中内毒素含量的影响

内毒素又称为脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，只有在细菌死亡溶解时或人工破坏细胞后才释放出来^[25]。动物肠道内病原菌数量增多及肠道屏障破坏，使肠道中及进入体内的内毒素含量增多^[26]，对宿主具有强烈毒性^[27]，会导致机体急性肠道形态损伤和肠道屏障功能的崩溃^[28]。余嘉瑶等^[29]研究发现，在脂多糖免疫应激状态下，仔猪回肠黏膜中丙二醛(MDA)含量显著升高。表明在脂多糖免疫应激状态下，肠道内脂质过氧化物产物增多，会导致机体肠道内严重损伤，而微生态制剂具有降低LPS，改善机体营养状况，保护肝脏的作用^[21]。赵迪^[30]研究发现，在饲粮中添加复方芽孢杆菌能显著缓解脂多糖刺激导致仔猪肝脏中促炎因子白细胞介素(IL)-8 mRNA表达量的升高和结肠中抗炎因子IL-10 mRNA表达量的降低。本试验中，与对照组相比，添加100 mg/kg BS对血浆和肌肉中内毒素含量有降低趋势。BS作用于肠道，通过改善肠道微生物平衡、提高肠道黏膜屏障、减少肠道内病原菌数量^[6]，进而降低肠道中及进入体内的内毒素含量。

3.4 BS对肥育猪粪便菌群相对含量的影响

产气荚膜梭菌是目前临床最常见的一种气性坏疽病原菌，在一定条件下会导致气性坏疽、肠胃炎性食物中毒或传染性肠毒血症并快速死亡等疾病发生，对养殖业造成巨大经济损失。Jayaraman等^[31]研究表明，BS能够抑制由产气荚膜梭菌引起的肉仔鸡坏死性肠炎，提高肉仔鸡肠道健康水平。本试验研究发现，饲粮中添加BS能显著增加肥育猪粪便中双歧杆菌相对含量，添加100 mg/kg BS能显著提高巨大芽孢杆菌相对含量，添加200 mg/kg BS极显著降低产气荚膜梭菌相对含量，这与Li等^[32]研究结果基本一致。其原因可能是BS为需氧菌，当其进入胃肠道后，需消耗大量氧气来生长繁殖，创造厌氧环境，促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益厌氧菌在肠黏膜表面定植占位，并在肠道内产生有机酸，降低肠道内pH，抑制有害菌的生长^[33-34]。对于饲粮中添加100 mg/kg BS显著提高巨大芽孢杆菌相对含量，而添加200 mg/kg BS时不显著的原因可能有BS添加量有关。巨大芽孢杆菌和BS同属于需氧菌，其功能相似。添加100 mg/kg BS在肠道中耗氧量对巨大芽孢杆菌生长繁殖没有影响，但添加200 mg/kg时BS耗氧量增加，制约了巨大芽孢杆菌生长繁殖，具体原因仍需进一步的研究认证。

另外，BS对抑制肠道中大肠杆菌和沙门氏菌的研究结果不尽一致。Guo等^[35]和Maneewan等^[36]研究指出，BS可减少仔猪肠道中大肠杆菌和沙门氏菌数量，从而改善肠道环境和菌群结构，降低腹泻率。但也有研究表明，BS对肥育猪肠道中大肠杆菌和沙门氏菌抑制效果不明显^[37-38]。本试验中，与对照组相比，饲粮中添加200 mg/kg BS对肥育猪粪便中沙门氏菌和大肠杆菌相对含量有降低趋势。其原因可能是BS在仔猪上的效果比生长猪显著^[39]，本试验猪为生长后期的肥育猪，其机体的各项机能与消化道内的微生态区已趋于稳定和平衡，因此作用效果不显著。另外，针对BS显著降低产气荚膜梭菌的相对含量而对沙门氏菌和大肠杆菌效果不显著的具体原因，还需进一步的研究探讨。

4 结论

饲粮中添加BS可在一定程度上可以改善肥育猪机体代谢，增强机体免疫功能，优化肠道菌群。