2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
随着生活品质的提高和食品安全意识的觉醒，人们越来越关注抗生素药物在畜牧产品中残留导致的问题。自欧盟禁用抗生素后，为了奶牛养殖业的可持续发展，研究奶牛饲粮中应用植物源性添加剂、开发绿色植物源性饲料添加剂来替代化学添加剂成为一种必然趋势。竹叶中含有丰富的竹叶黄酮化合物，其主要以苷类的形式存在，研究发现竹叶中主要存在4种碳苷黄酮，分别为牡荆苷、荭草苷、异荭草苷、异牡荆苷，具有结构稳定、不易被降解、深入病灶部位、天然无害等特点[1-2]。竹叶提取物原料来源丰富，且具有良好的抗氧化活性、明确的抑菌功效和良好的食用安全性，对其提取及药理作用的研究日趋增多[3-4]。研究表明，植物黄酮类化合物具有抗过敏、抗炎、抗病毒和抗氧化活性的作用，还可以刺激中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T和B淋巴细胞及巨噬细胞活性，抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的产生及其基因表达[5]，并且以剂量依赖的方式影响核转录因子-κB(NF-κB)信号通路抑制TNF-α[6]，从而起到免疫调节的作用。竹叶提取物已被证实具有优良的自由基清除能力、抗氧化能力，并且其部分生物活性与超氧化物歧化酶(SOD)的活性相似[7]。有研究表明，竹叶提取物能够显著提高SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低丙二醛(MDA)含量，减少氧化应激引起的肝损伤[8]。到目前为止，有关奶牛饲粮中添加竹叶提取物对其免疫和抗氧化性能影响的研究鲜见报道。因此，本试验旨在研究竹叶提取物对奶牛泌乳性能、血液常规指标、免疫和抗氧化性能的影响，以期为竹叶提取物在奶牛饲粮中的科学添加及合理应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用竹叶提取物为棕黄色粉末，购自陕西森弗生物技术有限公司，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[9]测定其纯度为40%；竹叶提取物中还含有粗灰分(20.0%)、粗蛋白质(13.0%)、水溶性多糖(15.5%)等。
1.2 试验设计与饲养管理试验选取20头泌乳日龄、体重、胎次、产奶量相近且健康的中国荷斯坦奶牛为试验对象，采用完全随机设计原则随机分为4组，每组5个重复，每个重复1头牛，试验牛情况及分组见表 1。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加30、60、90 g/d的竹叶提取物。预试期14 d，正试期35 d。饲粮配方由试验牛场提供，基础饲粮组成及营养水平见表 2。竹叶提取物于每天晨饲前进行投喂，自由饮水，每天挤奶3次，挤奶时间分别为09:00、15:00、21:00。
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表 1 试验牛情况及分组 Table 1 Condition and grouping of test cows |
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
基础饲粮营养水平：干物质含量采用烘箱干燥法测定，粗蛋白质含量参照GB/T 6433—2006进行测定，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量参照GB/T 6434—2006进行测定，钙含量参照GB/T 6436—2018进行测定，磷含量参照GB/T 6437—2018进行测定。
泌乳性能：于正试期第1、7、14、21、35天进行乳样采集，将早、中、晚奶4:3:3进行混合置于奶牛群体改良(DHI)专用瓶，4 ℃保存，乳成分分析仪进行乳成分测定。每天记录试验牛的奶产量。
血液常规指标：血液白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量和含量，由美国IDEXX Catalyst One全自动血液生化分析仪进行测定。
血浆免疫和抗氧化指标：于正试期第1、7、14、21、35天晨饲后3 h进行血液采集，酒精擦拭奶牛尾静脉处皮肤后，用注射器进行采血，采血后用消毒棉球再次擦拭。取10 mL血样注入事先标记好含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝一次性采血管中，室温静置30 min后3 000×g离心15 min后获取血浆，置于2 mL离心管中，-80 ℃冷冻保存，用于血浆免疫和抗氧化指标的检测。
血浆中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)含量均用南京森贝伽生物科技有限公司酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定；SOD、过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px活性及MDA含量均用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。以上操作按试剂盒说明书进行。
1.4 数据处理试验数据经Excel 2010进行初步整理后，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析、线性分析和二次相关分析，以SNK和Duncan氏法进行多重比较，并以P＜0.05为差异显著性判断的标准。分析模型为：
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式中：Yijk为因变量值；μ为总体均值；Pi为试验期效应(i=1~6)；Cj为试验奶牛的效应(j=1~4)；Tk为饲粮处理效应(k=1~4)；Eijk为随机误差。
2 结果 2.1 竹叶提取物对奶牛泌乳性能的影响由表 3可知，饲粮中添加竹叶提取物对奶牛产奶量无显著影响(P＞0.05)，但与对照组相比，试验组奶牛产奶量均有所升高。试验组乳糖率均显著高于对照组(P＜0.05)，30 g/d组乳蛋白率显著高于其他各组(P＜0.05)，30 g/d组乳脂校正率显著高于对照组(P＜0.05)，90 g/d组体细胞数显著低于其他各组(P＜0.05)。
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表 3 竹叶提取物对奶牛泌乳性能的影响 Table 3 Effects of bamboo leaf extracts on lactation performance of dairy cows |
由表 4可知，随着饲粮中竹叶提取物添加水平的升高，奶牛血液淋巴细胞、中性粒细胞数量和含量均有所升高。其中，60 g/d组血液淋巴细胞数量和含量显著高于对照组(P＜0.05)，30、60 g/d组血液中性粒细胞数量和含量显著高于对照组(P＜0.05)。随着饲粮中竹叶提取物添加水平的升高，奶牛血液红细胞、嗜酸性粒细胞数量均有所升高，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 4 竹叶提取物对奶牛血液常规指标的影响 Table 4 Effects of bamboo leaf extracts on blood routine indexes of dairy cows |
由表 5可知，30 g/d组血浆中IgM、IgA、IgG含量显著高于对照组(P＜0.05)，其中，试验组血浆中IgG含量均显著高于对照组(P＜0.05)。随着饲粮中竹叶提取物添加水平的升高，血浆中IgM、IgA、IgG含量呈下降趋势。
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表 5 竹叶提取物对奶牛血浆免疫指标的影响 Table 5 Effects of bamboo leaf extracts on plasma immune indexes of dairy cows |
由表 6可知，试验组血浆中CAT、SOD、GSH-Px活性均显著高于对照组(P＜0.05)，但各试验组之间无显著差异(P＞0.05)。试验组血浆中MDA含量均显著低于对照组(P＜0.05)，但各试验组之间无显著差异(P＞0.05)。随着饲粮中竹叶提取物添加水平的升高，血浆中GSH-Px活性呈先升高后下降的二次曲线趋势(P＜0.05)，其中60 g/d组血浆中GSH-Px活性最高；血浆中SOD活性随呈线性升高趋势(P＜0.05)。
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表 6 竹叶提取物对奶牛血浆抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of bamboo leaf extracts on plasma antioxidant indexes of dairy cows |
植物提取物中含有丰富的黄酮化合物，其中高剂量的王不留行能够提高泌乳中期奶牛的奶产量，但对乳蛋白率和乳脂率没有显著影响[11]。饲粮中添加葛根提取物能够提高乳中脂肪和蛋白质含量，但对奶产量没有显著影响[12]。本试验中，饲粮中添加竹叶提取物虽然对奶牛奶产量没有显著影响，但是30 g/d组显著提高了乳糖率、乳脂校正率和乳蛋白率。这可能是由于竹叶提取物中黄酮含量较高的原因，其余结果与贾若愚[13]的研究结果一致。竹叶提取物不仅含有丰富的黄酮类化合物，还含有赖氨酸、蛋氨酸在内的7种必需氨基酸。王放银[14]研究表明，奶牛饲粮中添加蛋氨酸可以通过调节低密度脂蛋白的合成继而影响乳脂合成。体细胞数是衡量奶牛乳房健康状态的非常重要的间接指标，本试验中，高剂量(90 g/d)的竹叶提取物能够显著降低乳中体细胞数，进而降低奶牛乳腺炎症发生概率。
3.2 竹叶提取物对奶牛血液常规指标和免疫性能的影响淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要细胞成分。中性粒细胞和单核细胞都具有运动能力和吞噬功能，前者吞噬并杀灭入侵微生物，后者通过激活淋巴细胞发挥特异性免疫作用[15]。有研究表明，添加适量的沙葱黄酮和杜仲黄酮能够增加淋巴细胞的数量。随着黄酮浓度的升高，淋巴细胞数量与之呈负相关[16]。本试验中，饲粮中添加竹叶提取物提高了奶牛血液中性粒细胞和淋巴细胞的数量和含量，有助于提高机体防御能力，而高剂量(90 g/d)组与其他试验组相比有抑制淋巴细胞的增殖的趋势，说明添加适量的竹叶提取物能够提高奶牛的细胞免疫。
B淋巴细胞增殖分化之后产生特异性免疫球蛋白，免疫球蛋白主要参与体液免疫的过程，在机体抵抗细菌和病毒感染方面起着重要作用，其含量可以反映出机体的免疫状态[17]。来自大豆的黄酮类化合物可以增加奶牛血浆和乳汁中IgA和IgG含量，而从蜂胶中提取的黄酮类化合物可降低荷斯坦牛犊血浆中的IgG和IgM含量[18-20]。据报道，黄酮类化合物可通过重新调节IgG和IgM的含量来影响体液免疫应答，低剂量的苜蓿黄酮可以提高奶牛血浆中IgG含量[21]。本试验中，饲粮中添加低剂量(30 g/d)竹叶提取物显著提高了血浆中IgG、IgM和IgA含量，且随着竹叶提取物添加水平的升高，血浆中IgG、IgM和IgA含量呈下降趋势，但仍高于对照组，与Zhan等[20]研究结果一致。以上结果说明，竹叶提取物能够通过调节免疫球蛋白的分泌进而调节机体体液免疫。
3.3 竹叶提取物对奶牛抗氧化性能的影响研究表明，氧化应激会导致许多慢性疾病的发生。当氧化平衡被打破时，会导致机体组织细胞结构被破坏，甚至导致细胞凋亡等[21]。黄酮类化合物在生物系统中因具有抗氧化能力，所以可以保护机体免受过氧化物的损害[22-23]。GSH-Px、SOD、CAT活性变化及MDA的含量变化能够反映出机体抗氧化能力，其中MDA是脂质过氧化的终产物，也是代表细胞损伤的指标之一，GSH-Px、SOD、CAT能够消除自由基并且能够抑制MDA的生成，维持氧化的动态平衡[24]。研究发现苜蓿黄酮可以通过增加CAT和GSH-Px的活性，降低MDA的含量来提高乳腺上皮细胞的抗氧化能力[25]。杜仲叶黄酮苷不仅可以降低MDA的含量，还可以提高T-SOD的活性[26]。本试验结果表明，奶牛饲粮中添加竹叶提取物可以显著提高血浆中GSH-Px、SOD和CAT活性，并且显著降低血浆中MDA含量，与Zhang等[8]的研究结果一致，表明竹叶提取物可以增强奶牛抗氧化功能。
4 结论① 饲粮中添加竹叶提取物能够提高牛奶中乳蛋白率和乳糖率，降低体细胞数，进而提高牛奶品质。
② 饲粮中添加竹叶提取物能够提高奶牛血液淋巴细胞、中性粒细胞数量和含量，提高血浆中IgM、IgA、IgG含量及GSH-Px、SOD、CAT活性，降低血浆中MDA含量，进而增强机体免疫和抗氧化性能。
③ 综上所述，综合考虑奶牛泌乳性能、免疫和抗氧化性能，本试验条件下，饲粮中竹叶提取物适宜添加水平为30 g/d。
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