生物饵料是水生动物人工繁育过程中主要的饲料来源，并广泛应用于养殖对象苗种培育，合理选择饵料是苗种繁育成功与否的关键因素之一^[1]。动物生长发育主要需要蛋白质、碳水化合物及脂类三大营养物质，同时，微量元素、维生素及多不饱和脂肪酸等营养因子对养殖对象的生长发育也起着重要作用^[2]。生物饵料营养组成存在诸多差异，并存在一定程度的营养缺陷，尤其是缺乏高度不饱和脂肪酸^[3]。依据养殖对象不同发育阶段营养需求，通过筛选、定向培养及营养强化，获得满足其营养需求的生物饵料具有十分重要的意义^[4]。

宽体金线蛭(Whitmania pigra)，俗称蚂蟥，是我国传统的中药材之一。宽体金线蛭野生群体数量急剧下降，其养殖活动日趋受到重视。近年来，研究者对宽体金线蛭人工繁殖及苗种培育技术方面进行了诸多研究。研究者初步分析了不同生态环境因子如光照^[5]、温度和pH^[6-7]、耗氧率^[8]等对宽体金线蛭生长发育的影响，并对优质饵料和投喂策略^[9]以及养殖密度^[10]进行了筛选和优化，为宽体金线蛭规模化养殖提供了初步理论参考，但在幼蛭营养需求和疾病防治方面的研究仍较少。

宽体金线蛭苗种存在生长速度慢、死亡率高两大瓶颈^[5]，能否筛选出大小适口、易于摄取、满足幼蛭营养需求的生物饵料，使其安全度过此薄弱环节，是其苗种繁育成功与否的关键因素之一。目前，人工养殖条件下，主要依据宽体金线蛭不同生长阶段，采用大小规格不同的螺蛳作为饵料，来源较为单一^[8]。饲料营养不仅影响水生动物的生长发育，而且影响其健康、免疫及抗病力^[11]。营养物质是促进机体免疫器官发育的基础，优质饵料不仅可以满足养殖对象的营养需求，还能够提高免疫力和抗病力^[12]，降低机体对病原菌的易感性。目前水蛭配合饲料仍未研制成功，选择适宜的生物饵料来满足其营养需求，仍是人们关注与探讨的焦点。已有研究者以宽体金线蛭幼蛭摄食和生长性能为指标，对生物饵料进行了初步筛选和评价^[13-15]，而不同生物饵料对幼蛭消化吸收和免疫性能的影响均未涉及。因此，本试验拟研究3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭诱发捕食与生长性能的影响，同时分析这3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭消化酶活性、免疫力的影响，旨在优化宽体金线蛭苗种人工繁育生物饵料，为其规模化生产提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用宽体金线蛭卵茧来源于江苏灏源科技股份有限公司。收取野生种蛭后，采用温室大棚繁殖技术，经过20 d左右，种蛭产茧活动结束，人工收集卵茧，室内孵化。生物饵料：方形环棱螺(Bellamya quadrata)(俗称螺蛳)、耳萝卜螺(Radix auricularia)(俗称漂螺)、赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)(俗称蚯蚓)。

1.2 试验设计和饲养管理

随机挑选健康、活力强的幼蛭，放入水族箱内并及时投喂饵料，使其适应养殖环境。试验幼蛭初始平均体质量为(0.027±0.010) g。设置螺蛳组(对照组)、漂螺组、蚯蚓组3个组，每组设置3个重复，每个重复放置60条幼蛭，水族箱的排列采用随机区组设计。水族箱为长58 cm、宽48 cm、高20 cm的泡沫箱。各组饲喂对应的生物饵料，投喂时间为16:00，每隔3 d投喂1次，饱食投喂，次日清理残饵。每3 d换1次水，换水量为水族箱水体总体积的2/3。养殖水质指标：水温(26.3±1.2) ℃，溶氧浓度(6.73±0.84) mg/L，pH 7.82±0.51。试验养殖周期为30 d。

1.3 样品采集

试验结束后，每组随机选取20条幼蛭(酒精致死)，使用游标卡尺测量体长和体宽，采用电子天平测量体质量。采用10 mL量筒和滴定管测量幼蛭体积。具体方法为：幼蛭放入量筒底部，完全沉入水中时作为滴定终点，量筒内部水的总体积减去滴定管消耗的水的体积即为幼蛭体积。同时，每个重复取4条，每组共取12条幼蛭，全体样品急冻低温保存。取样前24 h停止投喂饵料，使肠道内容物排空。

1.4 指标测定

特定生长率(SGR)和成活率(SR)按照以下公式计算：

特定生长率(%/d)=100×(ln终末体质量- ln初始体质量)/试验天数；

成活率(%)=100×终末水蛭数量/初始水蛭数量。

准确称取全体样品重量，按重量(g) :体积(mL)=1 : 9，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液待测。上清液一部分用于消化酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)活性的测定，另一部分用于免疫指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性及总抗氧化能力(T-AOC)]的测定。上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.5 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件进行描述性统计及Duncan氏法多重比较检验，P < 0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果 2.1 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭生长性能的影响

各组宽体金线蛭幼蛭的生长性能见表 1。漂螺组幼蛭体质量、体长及体宽显著高于其他2组(P < 0.05)，螺蛳组幼蛭体质量、体长及体宽显著高于蚯蚓组(P < 0.05)。漂螺组幼蛭特定生长率显著高于螺蛳组和蚯蚓组(P < 0.05)，螺蛳组幼蛭特定生长率显著高于蚯蚓组(P < 0.05)。3组幼蛭体质量极差较大，其中螺蛳组幼蛭体质量最大值是最小值的59倍(最大值0.59 g，最小值0.01 g)，漂螺组为52倍(最大值1.03 g，最小值0.02 g)，蚯蚓组为5倍(最大值0.05 g，最小值0.01 g)。螺蛳组幼蛭成活率最高，但3组之间差异不显著(P>0.05)。

2.2 宽体金线蛭幼蛭各生长指标与体质量的相关性

幼蛭体长、体宽及体积与体质量的关系如图 1所示。幼蛭体长、体宽及体积与体质量之间的关系均满足幂函数关系，相关方程分别为y=0.019 6x^{2.388 7}、y=1.564 0x^{2.587 9}及y=1.441 2x^{1.444 2}。体质量与上述3个生长指标的相关性由强到弱依次为体积(R²=0.912 0)、体长(R²=0.888 8)、体宽(R²=0.771 7)。

2.3 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭消化酶活性的影响

3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭消化酶活性的影响见图 2。螺蛳组、漂螺组及蚯蚓组幼蛭蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)。螺蛳组幼蛭淀粉酶活性显著高于漂螺组和蚯蚓组(P < 0.05)，漂螺组和蚯蚓组幼蛭淀粉酶活性差异不显著(P>0.05)。漂螺组幼蛭脂肪酶活性显著高于螺蛳组和蚯蚓组(P < 0.05)，螺蛳组和蚯蚓组幼蛭脂肪酶活性差异不显著(P>0.05)。蚯蚓组幼蛭淀粉酶和脂肪酶活性最低，均显著低于螺蛳组和漂螺组(P < 0.05)。

2.4 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭免疫指标的影响

3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭没有指标的影响见图 3。螺蛳组和漂螺组幼蛭SOD活性分别比蚯蚓组高5.17%、8.10%，但3组之间差异不显著(P>0.05)。蚯蚓组幼蛭CAT活性显著高于螺蛳组和漂螺组(P < 0.05)，后两者之间无显著差异(P>0.05)。螺蛳组、漂螺组及蚯蚓组幼蛭T-AOC无显著差异(P>0.05)。蚯蚓组幼蛭LZM活性显著高于螺蛳组和漂螺组(P < 0.05)，螺蛳组和漂螺组之间无显著差异(P>0.05)。螺蛳组幼蛭AKP活性显著高于漂螺组和蚯蚓组(P < 0.05)，漂螺组幼蛭AKP活性比蚯蚓组高41.60%，但两者之间差异不显著(P>0.05)。螺蛳组幼蛭ACP活性显著高于漂螺组和蚯蚓组(P < 0.05)，漂螺组幼蛭ACP活性比蚯蚓组低6.90%，但两者之间差异不显著(P>0.05)。

3 讨论 3.1 宽体金线蛭幼蛭适宜生物饵料的筛选

野生水生动物的食性调查是筛选人工饵料和研发配合饲料的重要参考依据。不同研究者对野生宽体金线蛭的食性进行了考察，所得结果略有差异。王致祥等^[16]认为宽体金线蛭以水草、植物碎屑、有机质和微生物等为食，有时也捕食昆虫幼虫、椎实螺、蠕虫和水蚯蚓等。杨成胜^[17]认为宽体金线蛭为动物食性，在水体中幼蛭以浮游动物、底栖动物以及昆虫幼体等为食，成蛭则以螺类、蚌蚬类等软体动物汁液为食，也能摄食脊椎动物的血液等。王安纲等^[18]对野生资源进行调查后认为，宽体金线蛭主要是吸食无脊椎动物的体液或腐肉，尤其喜食螺蚌肠道内消化物，有时也吸食水面或者岸边的腐殖质。自然环境中，不同温度、光照、季节、区域及饵料丰富度等均与水生动物的摄食密切相关^[19]，这可能是造成不同研究者对宽体金线蛭食性结论不尽相同的主要原因。

3.2 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭生长性能的影响

本试验主要以目前人工养殖主要采用的螺蛳为对照，观察3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭生长发育的影响。研究发现，漂螺组幼蛭体质量、体长及特定生长率等生长指标显著高于螺蛳组和蚯蚓组，3组幼蛭整体生长性能由高至低为：漂螺组>螺蛳组>蚯蚓组。人工养殖水生动物的生长指标是评价饵料优劣的直接指标，与上述螺蛳和蚯蚓相比，漂螺更适宜作为宽体金线蛭幼蛭的生物饵料。相关研究发现，宽体金线蛭人工养殖过程中，在螺蛳饵料中添加原生动物对宽体金线蛭的生长有进一步的促进作用^[20]。田螺配合轮虫或者原生动物对菲牛蛭幼蛭的生长发育有显著的促进作用^[21]。宽体金线蛭不同适宜生物饵料的科学搭配种类和比例仍需进一步探讨。同时，本试验发现，各组宽体金线蛭幼蛭均存在大小差异较大的现象，所以建议在人工养殖过程中依据生长指标及时进行分苗处理。

3.3 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭消化酶活性的影响

消化酶活性与水生动物的生长发育存在密切关系，是反映水生动物营养生理的重要指标，其活性变化可反映水生动物在环境中的生理状态和对环境的适应性^[22]。饵料作为消化酶的作用底物，在养殖条件下，养殖对象消化酶的分泌在一定程度上会受投喂饵料的影响^[23]，其营养成分的种类和含量与消化酶活性密切相关^[24]。研究发现，不同饵料(虾肉、鱼肉、杂色蛤肉和蚯蚓)对云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)幼鱼胃蛋白酶活性的影响差异显著，但对脂肪酶和淀粉酶活性无显著影响^[25]。采用单一湛江等边金藻(Isochrysis zhanjiangensis)和青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)投喂厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝，其淀粉酶活性均显著低于这2种饵料混合投喂^[26]。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)幼虾消化酶活性与饵料密切相关，投喂丰年虫(Artemia salina)无节幼体组幼虾胃蛋白酶和胰蛋白酶活性极显著高于投喂草鱼鱼糜组^[27]。管角螺(Hemifusus tuba)摄食不同饵料后，各组消化酶活性存在显著差异，配合饲料组管角螺淀粉酶和脂肪酶活性先降后升，鲜活饵料组则较稳定^[28]。综上所述，水生动物在摄食不同饵料时，其体内蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶等消化酶活性的变化规律千差万别。本试验发现，摄食螺蛳、漂螺及蚯蚓的宽体金线蛭幼蛭消化酶活性也各不相同，螺蛳组幼蛭淀粉酶活性最高，漂螺组脂肪酶活性最高，而蚯蚓组幼蛭各消化酶活性均显著低于其他2组。该结果证实，宽体金线蛭幼蛭摄食不同饵料会直接影响消化酶活性，从而影响机体对于营养物质的消化吸收，而同等质量的脂肪完全氧化分解释放的能量远大于淀粉，这可能是造成漂螺组幼蛭生长性能显著高于螺蛳组的主要原因。

3.4 3种生物饵料对宽体金线蛭幼蛭免疫力的影响

水生动物免疫系统的发展与机能，取决于动物机体内营养的适宜和平衡，可以利用免疫学原理研究动物对饲料中营养的需求^[29]。因此，可以通过调控饲料营养成分增强养殖对象的免疫力，降低其疾病发生几率^[30-31]。改善饲料营养成分组成，通过摄食的方式来提高养殖对象的免疫力和抗病力较为普遍^[32-33]。人工配合饲料主要通过以下2种方式达到上述目的：1)调节蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、维生素及微量元素5大基础营养元素的含量^[34]；2)添加营养性或非营养性饲料添加剂，如蛋氨酸羟基类似物、谷氨酰胺、中草药、多聚糖、寡聚糖及微生态制剂等物质^[35]。生物饵料作为养殖动物直接摄食的对象，主要通过筛选饵料种类或营养强化的方式提高养殖对象的免疫力^[36]。本研究结果显示，蚯蚓组宽体金线蛭幼蛭的CAT和LZM活性显著高于螺蛳组和漂螺组，表明蚯蚓能够显著提高幼蛭机体非特异性免疫力。其原因可能是，蚯蚓生活环境特殊，体内活性成分和抗逆性成分含量都很高^[37-38]，可有效激活幼蛭相应的免疫系统，增强幼蛭的免疫力。然而，蚯蚓对宽体金线蛭幼蛭生长性能的促进作用显著低于螺蛳组和漂螺组。综合考虑，认为蚯蚓可作为幼蛭人工饲料免疫添加剂成分。

4 结论

漂螺对宽体金线蛭幼蛭生长性能有显著的促进作用，但在提高幼蛭免疫力方面与螺蛳和蚯蚓存在一定的差距，而蚯蚓可有效激活幼蛭相应的免疫系统，但促生长作用较差，建议人工养殖过程中可将上述生物饵料合理搭配投喂。同时，在宽体金线蛭幼蛭人工饲料研发方面，可依据漂螺营养成分初步制订幼蛭饲料标准，并将蚯蚓作为饲料免疫添加剂成分。另外，宽体金线蛭人工养殖过程中，由于幼蛭生长性能差异较大，需要不定期分苗，及时投喂不同规格的生物饵料，以满足其营养需求。