机体抗氧化系统与免疫系统密不可分,氧化应激状态下,动物生长性能下降,畜产品货架期缩短、品质降低,组织器官受损,机体细胞免疫和体液免疫受到抑制,免疫系统受到损伤[1-4]。动物免疫系统受损可引起发病率和死亡率升高,影响生产效率。近年来,以经济效益为主的集约化饲养模式下,肉鸡由于生长速度快、饲养密度高、氧化应激加强,很容易造成免疫功能降低进而影响生长性能。维生素A在1925年首次被认定为必需营养素,除对视觉、生长、生殖、造血等生理功能具有重要作用外,还可影响机体代谢,维持黏膜的完整性,增强机体非特异性免疫反应;增强T细胞的抗原特异性反应,参与细胞免疫;刺激抗体的产生,参与体液免疫,从而阻止机体感染[5]。我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)推荐肉鸡维生素A需要量分别为8 000(1~3周龄)、6 000(4~6周龄)和2 700 IU/kg(7周龄以上)。研究显示,在饲养标准基础上适当提高饲粮维生素A水平可增强机体抵抗外来病毒入侵的能力,降低畜禽发病率,促进机体免疫功能和生理调节。维生素A也是一种重要的非酶系统的抗氧化剂,具有抗氧化和清除自由基的功能[6];种鹅饲粮中维生素A添加水平为8 000~12 000 IU/kg时,能提高蛋品质,提高蛋黄抗氧化能力,降低脂质过氧化产物,提高种蛋的抗氧化性能[7];饲粮维生素A水平在1 000~18 000 IU/kg时,肉杂鸡血清新城疫抗体与饲粮维生素A水平呈显著的二次曲线回归关系,维生素A水平为12 000 IU/kg时效价最高,血清禽流感H9抗体效价也随饲粮维生素A水平的增加有增加趋势[8]。目前在肉鸡生长具有周期短、饲养密度大和易染病的情况下,常常添加高水平维生素A来增强肉鸡的抗氧化和免疫机能[9],但研究表明,添加高水平维生素A不仅增加饲料成本,加重机体代谢负担,而且影响动物生长性能的发挥。本课题组前期研究表明,饲粮中维生素A的添加水平达到15 000 IU/kg以上,可引起肉鸡生长性能降低,同时使得骨骼强度降低,骨骼代谢异常[10]。因此,在肉鸡生产中合理添加维生素A以促进其生长性能充分发挥的同时,保证肉鸡较高的抗氧化与免疫功能是非常必要的。然而,目前研究维生素A对肉鸡免疫功能的影响多是通过免疫器官指数等指标来说明,对免疫细胞因子的研究较少,关于维生素A提高免疫机能的添加水平的研究报道也不尽一致,且大多研究是针对其他动物而非肉鸡,关于维生素A对肉鸡抗氧化功能的研究较少,也无一致结果。因此,本试验通过研究饲粮中添加不同水平维生素A对肉鸡生长性能、血清免疫细胞因子和抗氧化指标的影响,探讨维生素A的适宜添加水平,为肉鸡饲粮中维生素A的合理使用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及试验设计试验用维生素A制剂的维生素A含量500 000 IU/g,由内蒙古蒙泰大地生物技术发展有限责任公司提供。爱拔益加(AA)肉鸡苗由内蒙古悦安养殖有限公司提供。采用单因子完全随机试验,选取1日龄健康AA肉鸡240只(公母各占1/2),各组鸡的初始体重经方差检验差异不显著(P>0.05),随机分为5个组,每个组6个重复,每个重复8只鸡。参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004),根据课题的前期研究成果及前人研究结果,分别在基础饲粮中添加3 000、6 000、15 000、30 000和45 000 IU/kg维生素A。
1.2 饲养管理与基础饲粮试验选用有窗封闭鸡舍,每笼8只肉鸡饲养在4层层叠式立体鸡笼中。饲养分为1~21日龄和22~42日龄2个阶段,试验期42 d。试验期间自由采食与饮水,鸡舍环境及饲养管理均保持一致,每周消毒,按常规免疫程序免疫,每组的6个重复按鸡笼的位置不同排列分开,各组试验条件保持一致。试验采用玉米-豆粕型基础饲粮,参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表 1,基础饲粮中除维生素A外,其他营养成分均满足肉鸡的营养需要。
在21和42日龄,每重复随机抽取2只鸡,颈静脉放血处死,采集血样10 mL,4 ℃、3 000 r/min离心10 min制备血清,-20 ℃冷冻保存备用。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长性能指标试验期每周每重复肉鸡空腹称重,结料,计算每阶段试验鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.4.2 免疫功能指标酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国R & D公司)测定血清白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,详细步骤参考试剂盒说明书。
1.4.3 抗氧化功能指标试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC),MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定,CAT活性采用可见光法测定,T-SOD活性采用羟胺法测定,GSH-Px活性和T-AOC采用比色法测定,详细步骤参考试剂盒说明书。
1.5 数据处理采用SAS 9.0进行方差和回归统计分析,P < 0.05表示组间差异或回归关系显著,0.05≤P < 0.10表示组间差异或回归关系有增加或减少的趋势。
2 结果 2.1 生长性能由表 2可见,饲粮添加不同水平维生素A对22~42日龄ADG有显著影响(P=0.035),3 000 IU/kg组最低,显著低于15 000 IU/kg组(P < 0.05);对22~42日龄及1~42日龄ADFI有显著影响(P=0.019,P=0.019),30 000和45 000 IU/kg组ADFI均较高,显著高于6 000 IU/kg组(P < 0.05),且随饲粮维生素A添加水平的增加均呈线性升高(R2=0.751 3,P=0.057;R2=0.872 1,P=0.022);对22~42日龄F/G有降低的趋势(P=0.065),6 000和15 000 IU/kg组低于45 000 IU/kg组,且1~42日龄F/G随饲粮维生素A添加水平的增加呈线性升高趋势(R2=0.669 4,P=0.091),其中30 000和45 000 IU/kg组较高。
由表 3可见,饲粮添加不同水平维生素A对21和42日龄血清IL-1含量有显著影响(P=0.020,P < 0.001),其中21日龄以15 000、30 000和45 000 IU/kg组显著高于3 000和6 000 IU/kg组(P < 0.05);42日龄时,15 000 IU/kg组显著高于3 000、6 000和45 000 IU/kg组(P < 0.05);对42日龄血清IL-2含量有增加的趋势(P=0.075);对42日龄血清IL-6和TNF-α含量有显著影响(P=0.023,P=0.049),且均以15 000 IU/kg组显著高于3 000和6 000 IU/kg组(P < 0.05)。
由表 4可见,饲粮添加不同水平维生素A对42日龄血清CAT活性有显著影响(P=0.010),15 000和30 000 IU/kg组显著高于3 000 IU/kg组(P<0.05);对21和42日龄血清GSH-Px活性有显著影响(P=0.014,P=0.042),其中21日龄的变化规律与42日龄血清CAT活性一致,42日龄6 000 IU/kg组显著高于45 000 IU/kg组(P < 0.05);42日龄血清T-SOD活性随维生素A添加水平的增加呈显著的二次曲线增加(R2=0.951 0,P=0.049),以45 000 IU/kg组较低;21日龄血清MDA含量呈线性升高趋势(R2=0.716 9,P= 0.070),42日龄血清MDA含量呈显著的线性升高(R2=0.867 9,P=0.021),且均在45 000 IU/kg组达到最高。
动物机体内有两大清除自由基的体系:酶系和非酶系,其中抗氧化酶体系起着重要作用。T-SOD、T-AOC、GSH-Px和CAT都是抗氧化酶体系中的重要酶,其活性与机体清除自由基的能力呈正相关,而MDA是细胞脂质过氧化反应的产物,其含量可间接反映自由基产生的情况和组织细胞的损伤程度。SOD能有效清除超氧化物阴离子自由基,高水平维生素A能提高肝脏铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn-SOD)活性[11]。维生素A能提高抗氧化酶活性,增强机体清除自由基的能力,维持机体氧化还原平衡,但过高水平维生素A则引起抗氧化能力降低,肉鸡血清GSH-Px活性随饲粮维生素A水平的增加呈抛物线模型,在添加水平为12 000 IU/kg时达到最高,添加水平增加至24 000和48 000 IU/kg时降低[12]。本试验的结果也证实了这一观点,结果显示,在42日龄,15 000和30 000 IU/kg组血清CAT活性显著高于3 000 IU/kg组;42日龄血清T-SOD活性随饲粮维生素A添加水平的增加呈显著的二次曲线增加,其中以45 000 IU/kg组较低;血清GSH-Px活性在维生素A添加水平为15 000 IU/kg时达到最高,30 000和45 000 IU/kg时呈下降趋势,而血清MDA含量随维生素A添加水平的增加呈线性升高趋势,且在添加水平为45 000 IU/kg时达到最高,提示15 000 IU/kg的维生素A可提高肉鸡的抗氧化功能,但过高水平(3 0000、45 000 IU/kg)的维生素A并不能进一步提高肉鸡的抗氧化能力,反而会降低GSH-Px活性,加深机体脂质过氧化程度,这是因为过高水平维生素A破坏机体抗氧化酶系统,降低机体合成GSH-Px的能力[11]。此外,机体对维生素A和维生素E的吸收利用及脂质过氧化中存在拮抗作用有关,过量添加维生素A会干扰维生素E吸收,引起血液和肝脏的维生素E含量降低,从而使机体氧化和抗氧化状态失衡,严重时可能导致维生素E缺乏症[13]。Sünder等[14]以蛋鸡为试验动物也得出了相似的结果。
免疫细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成和分泌的一类调节细胞功能的高活性、多功能的多肽或蛋白质。免疫应激会导致免疫细胞分泌炎性细胞因子,如IL-1、IL-6和TNF-α等,这些细胞因子在局部作用于免疫细胞,增强免疫反应[15]。IL-1是体内作用最强的炎症介质之一,能介导多种炎症反应,在免疫反应过程中,能刺激T淋巴细胞分泌IL-2并表达其受体,协同IL-2促进淋巴因子激活的杀伤细胞产生,激活自然杀伤细胞并诱导杀肿瘤活性。IL-2具有广谱的免疫增强活性,是保障机体正常免疫功能的关键环节。IL-6具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能,并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。TNF-α是具有多种生物活性的细胞因子,不仅能够抗肿瘤,而且对多种免疫和炎症反应的效应细胞都有调节作用。维生素A作为一种重要的非酶系统的抗氧化剂,具有抗氧化和清除自由基的功能[6],不仅能够提高动物的抗氧化能力,同时能够增强免疫机能。本试验结果显示,饲粮维生素A添加水平为15 000 IU/kg时,21日龄血清IL-1含量和42日龄血清IL-1、IL-6和TNF-α含量最高,提示免疫功能增强,维生素A添加水平高于15 000 IU/kg的组肉鸡血清免疫细胞因子的含量有下降趋势,提示免疫功能降低。可见,维生素A对肉鸡抗氧化与免疫功能的影响与其添加水平有关,15 000 IU/kg组肉鸡在促进了抗氧化功能的同时,也促进了免疫功能,而30 000和45 000 IU/kg维生素A则引起抗氧化与免疫功能降低,抗氧化与免疫功能的变化趋势相似。这是因为免疫细胞对机体氧化应激非常敏感,免疫细胞细胞膜含有一种高浓度不饱和脂肪酸,这种不饱和脂肪酸对过氧化反应高度敏感,因此,当免疫细胞受到氧化应激后免疫功能下降,进而影响机体的免疫系统功能[16]。前人关于维生素A对免疫功能影响的研究多集中在人和其他动物上,对肉鸡上的研究甚少,且研究结果不尽一致。饲粮维生素A添加4 000~16 000 IU/kg对蛋鸡血清IL-2含量无显著影响,但极显著影响TNF-α含量,4 000 IU/kg组TNF-α含量最低[17];而庞建建等[18]的研究则指出,饲粮添加4 000 IU/kg的维生素A可提高肉鸡和蛋鸡的生长性能和免疫机能,并升高血清IL-2含量。本试验只是从部分抗氧化指标和免疫指标的角度探讨了维生素A对肉鸡抗氧化与免疫功能的影响,但其详细的影响机理还有待于进一步探讨。
本试验结果也表明,过高水平维生素A在降低机体抗氧化与免疫功能的同时,也影响了其生长性能的发挥,在整个试验期,与6 000和15 000 IU/kg组相比,3 000 IU/kg组肉鸡虽F/G较低,但增重效果不佳,30 000和45 000 IU/kg组肉鸡ADFI较大、F/G不同程度升高,提示6 000和15 000 IU/kg组的肉鸡生长性能较好,添加过高水平维生素A会使饲料转化效率降低,对肉鸡生长性能有负面影响。研究表明,饲粮添加过高水平维生素A会导致动物代谢紊乱,骨骼发育受阻,生长性能下降,高水平维生素A(60 000 IU/kg)会显著抑制肉鸡生长,增大F/G[19]。饲粮添加6 000 IU/kg维生素A能使22~42日龄的黄羽肉鸡获得最大体重和饲料转化率,添加水平>12 000 IU/kg时生长性能显著降低[20];3 000 IU/kg维生素A可使肉鸡获得最大生长速度,添加水平高于15 000 IU/kg会使其生长速度呈下降趋势[21];然而,也有研究结果表明,8 800 IU/kg的维生素A就会对肉鸡的生长性能产生不利影响,导致体重下降和饲料转化率降低[22]。而郝哓洁[23]的研究表明,饲粮添加24 000和48 000 IU/kg维生素A可显著增加肉鸡生长后期ADG,导致这些研究结果不一致的原因可能是肉鸡的品种、生长阶段、饲粮其他营养素水平不同等。
综合本试验的生长性能、抗氧化与免疫指标结果,30 000和45 000 IU/kg维生素A降低了肉鸡生长性能、免疫和抗氧化机能,添加水平为15 000 IU/kg时肉鸡生长性能较好,亦可满足肉鸡免疫和抗氧化需要,饲粮维生素A添加水平为6 000 IU/kg时肉鸡生长性能较好,但抗氧化与免疫功能较低。
4 结论在本试验条件下,饲粮维生素A添加水平为6 000和15 000 IU/kg时肉鸡生长性能较好;15 000 IU/kg维生素A可满足肉鸡免疫和抗氧化需要,30 000和45 000 IU/kg维生素A影响肉鸡的生长性能、免疫和抗氧化机能。
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