谷氨酰胺(Gln)是动物血液和游离氨基酸库中最丰富的氨基酸，是动物能量源和蛋白质合成的前体^[1]，在维持肠道和免疫系统的正常形态和功能方面有着重要的作用^[2]。但谷氨酰胺稳定性较差，动物无法有效吸收利用谷氨酰胺单体，且在实际生产中较为困难。目前，作为谷氨酰胺替代品的丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)、甘氨酰-谷氨酰胺(Gly-Gln)可弥补谷氨酰胺单体的吸收缺陷，这类谷氨酰胺二肽被动物摄取之后，在体内能快速水解释放，提升血液中谷氨酰胺含量，更高效发挥谷氨酰胺作用^[3]。由于动物自身合成的谷氨酰胺远远不能满足自身需要，因此，谷氨酰胺二肽(Gly-Glu)作为外源性谷氨酰胺成为了水产动物营养研究的热点。已有研究表明，肠外补充的谷氨酰胺二肽被水解为谷氨酰胺后，能够改善肠道屏障功能^[4]，且被肠道消化吸收后，通过提高机体蛋白质的合成和增强非特异免疫力促进动物的生长^{[2, 5-6]}。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，草鱼属，为中国“四大家鱼”之一，广泛分布于我国淡水水域。随着近些年草鱼规模化养殖的逐年扩大，商业饲料的大量投喂，水质恶化，以致造成草鱼免疫力低下，肠道受损，病害频发。本试验通过在饲料中添加谷氨酰胺二肽, 研究其对草鱼幼鱼生长、免疫和肠道形态结构的影响，旨在为配制合理健康的饲料提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验饲料

设定试验饲料中谷氨酰胺二肽(纯度为98%，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)添加量分别为0(对照)、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%。饲料原料粉碎后过60目筛，按照配方要求准确称量，混匀后用饲料制粒机挤压出1.5和2.0 mm粒径的颗粒饲料，在阴凉处风干后置于-20 ℃冷存备用。试验饲料组成及营养水平见表 1。

1.2 饲养管理

养殖试验在湖南省新化市车田江水库网箱养殖基地中进行。试验用草鱼幼鱼购自湖南省水产原种场，暂养于网箱(5 m×4 m×3 m)中，以基础饲料驯化2周。正式试验开始前，禁食24 h后取750尾健康、平均体重为(7.16±0.10) g的草鱼幼鱼，随机分为5组，每组3个重复，每个重复50尾，饲养于规格为1.5 m×1.5 m×1.5 m的网箱中，在试验开始的前4周投喂1.5 mm粒径的颗粒饲料，待鱼达到一定规格后，在试验的第5周开始投喂2.0 mm粒径的颗粒饲料，养殖试验期持续8周。养殖试验期间，记录每天的水温、天气、采食量和死亡条数。

1.3 样品采集与分析

试验结束后，禁食24 h，称重，统计存活率、末体重。从每个网箱中随机选取14尾草鱼，用丁香油麻醉，选取6尾草鱼尾静脉取血，静置24 h后，3 500 r/min离心10 min，取上清液分装制备血清，-80 ℃冰箱保存备用；选取5尾草鱼于冰上迅速解剖和剥离肠道，-80 ℃冰箱保存用于肠道消化酶活性的测定。另外，每个网箱随机选取3尾草鱼，置于冰盘中迅速解剖，分别取中肠，生理盐水(75%)洗净，固定于酒精醋酸福尔马林混合固定液(AFA)中用于肠道组织切片的制作。

1.4 指标测定 1.4.1 生长性能指标的测定

按下列公式计算生长性能指标:

增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(W_t-W₀)/W₀;

存活率(survival rate，SR，%)=100×N_t/N₀；

饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=F/(W_t-W₀)；

蛋白质效率(protein efficiency ratio，PER，%)=100×(W_t-W₀)/(I×P)。

式中:N_t为终末尾数；N₀为初始尾数；W_t为终末体重; W₀为初始体重; t为试验天数; F为饲料消耗量; I为摄入的干物质的含量，P为饲料中蛋白质的含量。

1.4.2 肠道消化酶与血清免疫指标的测定

肠道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性及血清谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、溶菌酶(LZM)活性, 血清总蛋白(TP)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、皮质醇(COR)、谷胱甘肽(GSH)含量及总抗氧化能力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定；血清补体3(C3)、补体4(C4)含量采用浙江伊利康生物技术有限公司的试剂盒测定；血清甘油三酯(TG)含量采用北京北化康泰临床试剂有限公司的试剂盒测定。

1.4.3 肠道组织形态的测定

中肠经过AFA固定、乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(5 μm)、苏木精-伊红(HE)染色、脱水、透明、中性树脂封片。在每组选取9张非连续性切片，用Leica MD4000B显微镜观察并拍照，每张切片随机选取3个视野，对3处视野内的小肠绒毛高度、隐窝深度、肌层厚度进行测量以及统计杯状细胞数量；图像由Motic Images Plus 6.0软件进行测量和计算(绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度、杯状细胞数量)，分别取其平均值作为该样品各指标的测定结果。

1.5 数据统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析，试验结果采用“平均值±标准差”表示。当差异显著(P＜0.05)时，则采用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果 2.1 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼生长性能的影响

由表 2可知，饲料中添加谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼存活率无显著影响(P>0.05)。饲料中添加谷氨酰胺二肽使得草鱼幼鱼生长性能呈上升的趋势，各添加组草鱼幼鱼增重率显著高于对照组(P < 0.05)，但各添加组间差异不显著(P>0.05)，各添加组饲料系数均显著低于对照组(P < 0.05)，蛋白质效率显著高于对照组(P < 0.05)。

2.2 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响

由表 3可知，随着饲料中谷氨酰胺二肽添加量的增加，肠道脂肪酶和胰蛋白酶活性呈先升高后降低的趋势，0.25%、0.50%组肠道脂肪酶和胰蛋白酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，0.75%、1.00%组肠道脂肪酶和胰蛋白酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。肠道淀粉酶的活性随着谷氨酰胺二肽添加量的增加呈下降的趋势，0.75%、1.00%组显著低于对照组(P < 0.05)。

2.3 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼血清生化指标的影响

从表 4可见，各添加组草鱼幼鱼血清总蛋白含量与对照组无显著差异(P>0.05)。当谷氨酰胺二肽的添加量超过0.50%时，血清葡萄糖含量呈上升趋势，其中0.75%组显著高于对照组(P < 0.05)。各添加组血清尿素氮含量差异不显著(P>0.05)，但均显著高于对照组(P < 0.05)。饲料中添加谷氨酰胺二肽有使血清甘油三酯和胆固醇含量下降的趋势，其中0.50%组血清胆固醇含量显著低于对照组(P < 0.05)，各添加组血清甘油三酯含量均显著低于对照组(P < 0.05)。当饲料中谷氨酰胺二肽添加量超过0.50%时，血清谷草转氨酶活性呈上升的趋势，其中0.75%、1.00%组血清谷草转氨酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，1.00%组血清谷丙转氨酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。

2.4 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼血清免疫指标的影响

由表 5可知，0.50%组草鱼幼鱼血清溶菌酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，当饲料中谷氨酰胺添加量高于0.50%时，使血清溶菌酶活性、补体4含量显著下降(P < 0.05)，皮质醇含量显著升高(P < 0.05)。饲料中添加谷氨酰胺二肽对血清补体3含量无显著影响(P＞0.05)。饲料中添加谷氨酰胺二肽有使血清谷胱甘肽含量、总抗氧化力有升高的趋势，其中0.25%、0.50%和0.75%组谷胱甘肽含量显著高于对照组(P < 0.05)，各添加组总抗氧化能力显著高于对照组(P < 0.05)。

2.5 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼肠道形态的影响

图 1显示，与对照组相比，饲料中添加谷氨酰胺二肽促进了肠道绒毛的发育，绒毛密度增加，且黏膜厚度和杯状细胞数量有所升高。

由表 6可知，饲料中添加谷氨酰胺二肽有使草鱼幼鱼肠道绒毛高度上升的趋势，但组间差异不显著(P>0.05)。饲料中添加谷氨酰胺二肽显著影响了肠道黏膜厚度、隐窝深度及杯状细胞数量，与对照组相比，0.50%组隐窝深度显著降低，肠道杯状细胞数量显著升高(P < 0.05)，超过0.50%的添加量使得肠道黏膜厚度显著升高(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼生长以及肠道消化酶活性的影响

研究认为，谷氨酰胺二肽被动物摄入后在体内能迅速水解释放出谷氨酰胺^[7]，而谷氨酰胺是动物体内的非必需氨基酸，能促进肠道对氨基酸和蛋白质的吸收，促进机体蛋白质的合成^[8-9]。本试验结果表明，饲料中添加谷氨酰胺二肽能够显著提高草鱼幼鱼的增重率、蛋白质效率和降低饲料系数。与在建鲤(Cyprinus carpiovar Jian)^[10]、镜鲤(Cyprinus carpio var. specularis)^[5]、军曹鱼(Rachycentron canadum)^[11]、哲罗鱼(Hucho taimen)^[12]的结果相似。此前本研究团队对谷氨酰胺添加效果的研究中发现，当饲料中谷氨酰胺的添加量超过0.60%时，生长效果呈显著下降趋势^[13]，与本试验的1.00%组促生长效果不一致。其主要原因是谷氨酰胺易形成对机体有害的焦谷氨酸和氨，从而降低其对生长性能的促进作用，而谷氨酰胺生成的谷氨酰胺二肽既可避免谷氨酰胺单体的缺点又具有促进水产动物免疫、抗氧化等生理功能^[14]。

鱼类消化酶活性受摄食、食物的生化组成以及其他因素的影响^[1]。在本试验中，草鱼幼鱼肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性随饲料中谷氨酰胺二肽添加量的升高呈先升高后降低的趋势，同时在谷氨酰胺二肽添加量超过0.50%后，淀粉酶活性显著下降。这表明适量的谷氨酰胺二肽能促进草鱼幼鱼对于蛋白质和脂肪的消化，但过高的谷氨酰胺二肽可能会加重肠道的负担，影响消化酶的分泌^[15]。这一结果与镜鲤^[5]、哲罗鱼^[6]等研究结果相似。

3.2 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼血清生化指标的影响

血清总蛋白与尿素氮是反映机体对于蛋白质吸收代谢的重要指标^[16]。本试验结果表明，各添加组草鱼幼鱼血清尿素氮含量差异不显著，但均高于对照组，推测可能是饲料中添加谷氨酰胺二肽加强了鱼体对蛋白质的代谢，使得血清尿素氮含量维持在比较高的水平，并且从总蛋白含量的变化趋势来看，在添加量为0.50%时总蛋白含量最高，表明适量的谷氨酰胺二肽在一定程度上促进了草鱼幼鱼体内蛋白质合成代谢。谷氨酰胺作为生糖氨基酸，能够参与糖异生作用生成葡萄糖。本试验表明，饲料中添加0.25%~0.50%的谷氨酰胺二肽对血清葡萄糖含量无显著影响，但随着谷氨酰胺二肽添加量的提高，其血清葡萄糖含量显著升高，其原因可能与谷氨酰胺二肽通过三羧酸循环参与草鱼幼鱼肝脏糖异生作用有关。血清甘油三酯和胆固醇能够反映出机体对脂类代谢状况，其含量的升高说明机体脂质代谢出现紊乱，肝功能受损^[17]。本试验结果表明，饲料中添加谷氨酰胺二肽降低了血清甘油三酯和胆固醇含量，适量的谷氨酰胺二肽(0.25%~0.50%)使得血清谷丙转氨酶活性呈下降趋势，但饲料中高含量的谷氨酰胺二肽导致血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著升高，这说明适量的谷氨酰胺二肽有助于草鱼幼鱼机体脂质代谢和肝功能，但过量添加会加重肝脏负荷，可能对肝脏造成损伤。

3.3 谷氨酰胺二肽对草鱼幼鱼免疫和肠道健康的影响

谷氨酰胺是鱼类强有效的免疫增强剂，能够促进白细胞呼吸爆发活力、吞噬活力和增殖^[18]，并且谷氨酰胺能够通过合成一氧化氮和多胺来刺激超氧阴离子的产生^[19]，对鱼类的非特异性免疫具有重要意义。溶菌酶和补体是鱼体内重要的非特异性免疫防御因子，是一种重要的杀菌溶菌物质^[20]，皮质醇属于糖皮质激素，由肾上腺分泌，是评价是否应激的重要指标^[13]。本试验中，饲料中添加0.50%谷氨酰胺二肽，使得草鱼幼鱼血清溶菌酶活性显著高于对照组，但饲料中谷氨酰胺二肽的添加量超过0.50%后，草鱼幼鱼血清溶菌酶活性和补体4含量显著下降，血清皮质醇含量显著升高。这说明适量的谷氨酰胺二肽能够激活溶菌酶活性, 提高草鱼幼鱼免疫力，但过高的谷氨酰胺二肽可能会造成鱼体出现应激，使机体免疫抑制^[10]，出现免疫力下降，不利于草鱼幼鱼健康生长。谷胱甘肽在机体抗氧化防御中起着至关重要的作用。在本试验，饲料中添加谷氨酰胺二肽能够显著提高草鱼幼鱼血清中谷胱甘肽含量、总抗氧化能力。这表明谷氨酰胺二肽能够提高草鱼幼鱼抗氧化能力。这一结果与断奶仔猪^[21]、建鲤^[10]相似。

鱼体健康是建立在自身内脏器官健康、组织结构和功能完整的基础上的。鱼类肠道不仅是重要的消化和吸收器官，同时还具有免疫、内分泌以及新陈代谢的功能^[22]。肠道绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度是衡量肠道消化吸收的重要指标^[23]，肠道上皮中的杯状细胞主要功能是分泌黏液，在一定程度上可以间接反映黏液层的状况，对于判断机体肠道黏膜屏障的完整性具有重要意义^[24]。在本试验条件下，饲料中添加0.50%谷氨酰胺二肽以后，能够促进草鱼幼鱼肠道黏膜厚度、杯状细胞数量增加。这一结果与对日本对虾(Penaeus japonicus)^[2]的研究结果类似。这说明草鱼幼鱼在摄入饲料中的谷氨酰胺二肽后，机体可通过增加肠道黏膜厚度来提高对于营养物质的消化吸收能力以及促进杯状细胞的分泌保证肠道黏膜屏障的完整。隐窝深度上升会造成鱼类肠内膜面积变小，降低鱼类对营养物质的消化吸收能力^[25]。在本试验中添加0.50%的谷氨酰胺二肽后，使得草鱼肠隐窝深度显著降低，这一结果表明，草鱼幼鱼饲料中谷氨酰胺二肽添加量为0.50%，有利于草鱼幼鱼对于营养物质的消化吸收。

4 结论

饲料中适量添加谷氨酰胺二肽可提高草鱼幼鱼营养物质代谢、提高免疫力以及促进肠道发育, 进而促进草鱼幼鱼健康生长。综合而言，饲料中谷氨酰胺二肽最适添加量为0.50%。