2. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001;
3. 石家庄市动物卫生监督所, 石家庄 050000;
4. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心, 保定 071001;
5. 保定市农业局, 保定 071000
2. College of Veterinary Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China;
3. Shijiazhuang Animal Health Inspection Institute, Shijiazhuang 050000, China;
4. Embryo Engineering and Technological Center of Cattle and Sheep of Hebei, Baoding 071001, China;
5. Baoding Animal Husbandry Workstation, Baoding 071000, China
近年来，我国畜牧业迅速发展，但由于优质粗饲料供给不足以及粗饲料利用率普遍较低等因素限制了畜禽生产性能最大程度的发挥。因此，当前饲喂水平下，提高粗饲料消化利用率对生产实践具有重要意义。饲料间组合效应是指不同饲料来源的营养物质、非营养物质以及抗营养物质间互作的整体效应，大量研究表明这种组合效应在饲料间广泛存在[1-4]，当饲料间的互作使饲料中某种养分的利用率或采食量高于各饲料的加权值时说明组合产生了正组合效应，反之，为负组合效应，二者相同为零组合效应[5-6]。Abduirazak等[7]发现，玉米秸秆与豆科牧草组合使用可以提高其消化率。吕永艳等[8]通过短期人工瘤胃技术研究了3种奶牛常用粗饲料间组合效应，结果表明青贮玉米秸-苜蓿、苜蓿-羊草、青贮玉米秸-羊草组合比例分别在60 : 40、80 : 20、40 : 60时综合组合效应指数最大，产生最大正组合效应。刁波等[9]采用体外产气法评定了燕麦青干草与玉树地区5种天然牧草不同比例组合对产气量及发酵产物的影响，试验通过产气量与干物质降解率(DMD)确定最优组合比例，结果表明燕麦青干草分别与藏嵩草、高山嵩草、高山嵩草杂类的组合比例为75 : 25时，与高山嵩草-异针茅组合比例为25 : 75时，与紫花针茅草组合比例为50 : 50时，获得最优组合效应。Udén等[10]在低质粗饲料中补充少量的精饲料时, 能明显提高粗饲料采食量，但继续提高饲粮中精饲料水平, 低质粗饲粮的采食量反而显著下降，这表明粗饲料和精饲料间存在组合效应。目前探讨混合粗饲料与精饲料的组合效应研究较少，因此，本试验旨在探究混合粗饲料(玉米秸秆青贮+羊草+燕麦草)与精饲料最优组合比例，为提高饲料利用价值、降低饲养成本、提高利润以及实践生产中合理配合饲粮提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验材料包括玉米秸秆青贮(河北省保定市)、羊草(黑龙江省哈尔滨市)和燕麦草(河北省张家口市)3种粗饲料组成的混合粗饲料(组成及营养水平见表 1)和精饲料(组成及营养水平见表 2)。原料经65 ℃烘干48 h至恒重，制成风干样，粉碎过20目筛，放置在密封干燥环境中贮存。
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表 1 混合粗饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the mixed roughage (DM basis) |
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表 2 精饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the concentrate (DM basis) |
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表 3 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 3 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
试验中瘤胃液供体动物为3头健康状况良好、安装永久性瘤胃瘘管的泌乳高峰期荷斯坦奶牛，试验牛能够在畜舍内自由运动，自由采食，自由饮水，预试期为15 d。瘤胃液供体牛饲粮组成及营养水平见表 3。
1.3 试验设计本试验采用单因素试验设计，探讨不同比例混合粗饲料与精饲料的组合效应。混合粗饲料玉米秸秆青贮:羊草:燕麦草为20 : 30 : 50，与精饲料以100 : 0、80 : 20、60 : 40、50 : 50、40 : 60、20 : 80以及0 : 100的比例进行组合，每个组合3个重复。混合粗饲料与精饲料不同比例组合的营养水平见表 4。
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表 4 混合粗饲料与精饲料不同比例组合的营养水平(干物质基础) Table 4 Nutrient levels of different ratio combinations of mixed roughage and concentrate (DM basis) |
人工瘤胃缓冲液参照Goering等[11]的方法配制，分别为:微量元素溶液(A液)、缓冲溶液(B液)、常量元素溶液(C液)、刃天青溶液(D液)和还原剂溶液(E液)，取520.2 mL蒸馏水+0.1 mL A液+208.1 mL B液+208.1 mL C液+1.0 mL D液，混匀后于39 ℃水浴锅中持续充入CO2备用，临用前加入62.4 mL E液，直至混合溶液由淡蓝色变为近无色。
1.4.2 体外发酵操作体外发酵参照郑玉琳[12]试验方法进行。试验前，准确称取1 g样品底物放入250 mL玻璃产气瓶中。于晨饲前采集到瘤胃液，经4层纱布过滤到充满CO2的保温瓶内暂存，混匀密封备用。将人工瘤胃缓冲液和瘤胃液按照4 : 1的体积比均匀混合，量取150 mL混合液置于充满CO2的产气瓶中，迅速盖上对应的传感器模块，将其放置在39 ℃的气浴恒温振荡器中开始体外培养，计时48 h后浸泡于冰水中终止发酵。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 饲料营养水平测定水分含量参照GB/T 6435—2014测定，粗脂肪(EE)含量参照GB/T 6433—2006测定，粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432—1994测定，粗灰分(Ash)含量参照GB/T6438—2007测定，钙(Ca)含量参照GB/T 6436—2002测定，磷(P)含量参照GB/T 6437—2002测定。中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量分别参照GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007方法，采用美国ANKOM A2000i全自动纤维仪测定。
1.5.2 产气量测定采用体外产气法即使用ANKOM RFS自动采集系统记录培养瓶在体外培养时所产生的压力，根据4、8、12、24、36、48 h累加产气压计算出各时间点累积产气量。公式如下:
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式中：Vx为39 ℃时产气体积(mL)；Vj为产气瓶顶部空间体积(mL)；Ppsi为气体测量系统自动记录的压力(psi)。
1.5.3 DMD将48 h体外降解残渣用已编号并称重的尼龙布过滤后，蒸馏水冲洗数次，直至冲洗干净，将尼龙布(残渣)置于烘箱中65 ℃烘48 h至恒重后称重，DMD计算公式如下：
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发酵48 h后立即用酸度计测定培养液pH，之后冰水终止发酵。氨态氮(NH3-N)含量采用冯宗慈等[13]的比色法测定。微生物蛋白(MCP)含量采用差速离心法和凯氏定氮法[14]测定。挥发性脂肪酸(VFA)含量采用气相色谱法[15](美国Agilent 7890A气相色谱仪)测定。
1.6 组合效应值单项组合效应指数(SFAEI)与多项组合效应指数(MFAEI)参照王旭[16]的方法计算。单项组合效应指数计算公式如下:
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多项组合效应指数为各单项组合效应指数之和。
1.7 数据处理采用SPSS 22.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，通过Duncan氏法对各组平均值进行多重比较，试验结果以平均值±标准差表示，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著；对组合效应指标与泌乳净能(NEL)、CP、NDF和ADF含量的相关性进行双变量回归分析(n=7)。
2 结果与分析 2.1 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对产气量的影响由表 5可知，随着发酵时间延长，产气量逐步上升。在发酵48 h时，产气量随着组合比例的增加而降低，变化范围在126.23~157.83 mL/g，其中100 : 0组、80 : 20组显著高于其他各组(P < 0.05)，但这2组之间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对产气量的影响 Table 5 Effects of different combination ratios of mixed roughage to concentrate on gas production |
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表 6 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对发酵指标的影响 Table 6 Effects of different combination ratios of mixed roughage to concentrate on fermentation indexes |
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表 7 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对VFA含量的影响 Table 7 Effects of different combination ratios of mixed roughage to concentrate on VFA contents |
由表 6可知，各组pH变化范围在6.53~6.86；DMD随着组合比例的增加而上升，变动范围在65.21%~85.16%；50 : 50组、40 : 60组MCP含量显著高于其余各组(P < 0.05)，但这2组之间差异不显著(P>0.05)；各组NH3-N含量变化范围在16.09~23.68 mg/dL。
2.3 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对VFA含量的影响由表 7可知，不同组合比例的VFA含量间存在较大差异。乙酸含量在17.30~24.80 mmol/L，其中以50 : 50组、40 : 60组显著高于其他各组(P < 0.05)，丙酸、丁酸含量分别在14.58~18.61 mmol/L、1.88~3.02 mmol/L，分别在50 : 50组、0 : 100组出现最大值，显著高于其他各组(P < 0.05)；乙酸/丙酸在0.97~1.62，总挥发性脂肪酸含量在36.09~45.83 mmol/L。
2.4 混合粗饲料和精饲料的组合效应由表 8可知，48 h产气量以80 : 20组最优，其余组均表现负组合效应；DMD效应值在0.043~0.013，其中50 : 50组、40 : 60组和20 : 80组为正组合效应；MCP在40 : 60组出现最大正组合效应，NH3-N在50 : 50组出现最大组合效应，为0.147；乙酸、丙酸效应值分别在-0.120~0.240、-0.087~0.137，均为50 : 50组出现最优正组合效应。综上所述，多项组合效应以50 : 50组合效果最优，对应效应值为0.816，即玉米秸秆青贮:羊草:燕麦草:精饲料为10 : 15 : 25 : 50时产生最大正组合效应，为最优比例。
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表 8 混合粗饲料和精饲料的组合效应 Table 8 Combined effects of mixed roughage and concentrate |
由表 9可知，NEL、CP含量与GP48 h呈极显著负相关(P < 0.01)，NDF、ADF含量与GP48 h呈极显著正相关(P < 0.01)；NEL、CP与DMD、丁酸含量呈极显著正相关(P < 0.01)，NDF、ADF含量与DMD、丁酸含量呈极显著负相关(P < 0.01)；NEL、CP、NDF、ADF含量与其他指标相关性均不显著(P > 0.05)。
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表 9 组合效应指标与CP、NDF、ADF含量及NEL相关性分析 Table 9 Correlation analysis of combined effect indexes and CP, NDF, ADF contents and NEL |
碳水化合物和CP的分解是瘤胃发酵主要产气来源，产气量不仅能说明饲料可发酵水平，还可以反映瘤胃微生物活性，即饲料可发酵水平越低，微生物活性越弱，致使产气量越少，反之产气量越高[17]。体外产气特点可以在一定程度上反映饲料在动物体内部降解规律。产气量不仅仅受饲料种类和组合比例的影响，与CP和碳水化合物发酵降解及协调同步极为相关，即瘤胃内能氮平衡状况。本试验结果表明在8 h前产气量随着组合比例增加而升高，可能因为精饲料中的NFC含量较高，使得可发酵底物利用率升高，产气量达到最大值[18]，与Zhang等[19]的稻草与苜蓿组合试验研究结果一致，因高含量CP能够为微生物提供充足的发酵底物，所以产气量最高。在发酵时间达到36 h时趋于平稳，48 h时产气量呈下降趋势，这可能由于在发酵后期，精饲料中可发酵营养物质已被微生物利用，粗饲料中的碳水化合物成为微生物发酵产生气体的主要来源，造成高粗饲料组的产气量大于高精料组，这与张洁等[20]研究结果一致。产气量最大值出现在组合比例为80 : 20组，可能是因为粗饲料中的营养物质缺乏，添加少量精饲料为发酵底物提供易发酵养分，优化能氮平衡有利于微生物早期大量繁殖，导致产气量上升。但组合饲料中易发酵碳水化合物含量添加过高时，会产生大量有机酸，降低瘤胃pH，抑制微生物生长，产气量反而降低[21]。本试验通过分析产气量与营养物质相关性分析可知，产气量与CP含量呈极显著负相关，与NDF、ADF含量呈极显著正相关，与汤少勋[22]研究结果一致。Cone等[23]研究表明酪蛋白含量与底物发酵产气量呈线性关系，产气量随着CP含量提高显著下降。
3.2 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对发酵指标的影响pH能反映瘤胃微生物活性强弱情况，也是评价营养物质分解状况的重要指标。通常瘤胃pH在6.0~7.0[24]，纤维素分解菌对pH较敏感，适宜范围在6.2~7.0。Mould等[25]研究表明，在粗饲料为主的饲粮中补饲易发酵降解的碳水化合物，可以明显降低pH和纤维素消化率，呈现负效应。本试验中各组pH在6.53~6.86，是瘤胃的适宜pH范围，可能是因为试验中人工缓冲液起到了缓冲作用，避免其大幅度变化。其与NEL、CP含量呈正相关趋势，与NDF和ADF含量呈负相关趋势。全精饲料组pH显著低于其他各组，与Chen等[26]的组合效应结果一致。
体外组合试验中，DMD可以反映饲料能够被微生物利用的程度，DMD越高则表明饲料被动物消化利用越充分，发酵越好，反之则说明发酵越差。家畜本身不具有分泌纤维消化类酶的能力，而纤维含量过高导致饲料在肠道内不被降解，因此阻碍了对其他营养物质消化利用[27]，因此，反刍动物瘤胃内微生物对纤维物质消化程度是影响DMD的重要因素[28]，本试验随精饲料添加比例的增加，CP含量提高，纤维含量降低，DMD显著升高，这可能由于精饲料内含丰富非纤维性碳水化合物，易于被瘤胃微生物分解和利用。DMD不仅包括对碳水化合物的消失率，还包含对CP的利用率，即能氮平衡的程度也会影响饲料的降解率[29]。Amos[30]研究指出，如果降低饲粮中CP含量会使干物质、淀粉、纤维素等营养物质利用率下降，产生负效应。
瘤胃内含氮物质主要分解产物为NH3-N，其含量因饲料不同差异较大，但大体上反映了瘤胃微生物降解饲料CP与合成MCP的动态平衡情况，或低或高的NH3-N均不利于瘤胃微生物生长繁殖。Murphy等[31]指出，微生物活动的NH3-N含量为6.3~27.5 mg/dL，也有研究表明，瘤胃液中适宜的NH3-N含量为3.3~8.0 mg/dL[32]。体外模拟试验中，发酵终产物因为缺少瘤胃壁吸收和排出机制，使其只能溶解于发酵瓶中，这可能发生微生物死亡、细菌溶菌、纤毛虫自溶等现象造成氨的释放[33]。本试验不同组合比例的NH3-N含量为16.09~23.68 mg/dL，且随精饲料添加比例增加，组合中CP含量增加，有利于充分发挥微生物活性，促进底物中蛋白质分解和转化，但合成MCP的速率与能量的供给是有限的，所以出现NH3-N含量升高的趋势。
NH3-N和能量是合成MCP的前提，如果碳氮不能协同释放，将降低MCP合成效率。Nocek[34]研究发现，饲粮中含大量的易发酵CP和碳水化合物能显著提升MCP含量，由此可知，碳水化合物与能量释放一致性影响着MCP的产生。本试验MCP含量在40 : 60组出现最大值，可能由于添加60%的精饲料使NH3-N、能量与碳架释放协调一致性得到提升，使整体营养结构更加均衡合理，从而促进微生物生长繁殖，合成更多的MCP。
3.3 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对VFA含量的影响VFA是反映饲料发酵水平的重要指标，能够供给生命所需70%~80%的能量[35]。95% VFA为乙酸、丙酸和丁酸，乙酸为生成乳脂原料之一，丙酸为合成葡萄糖前体，乙酸/丙酸能反映瘤胃发酵类型，丙酸型发酵能产生许多能量用于家畜育肥[36]。本试验中乙酸含量大于丙酸和丁酸含量，符合瘤胃中乙酸含量最大的客观事实，Copani等[37]也有此研究结果。本试验结果表明随精饲料添加比例的增加，丙酸含量有降低趋势，乙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸含量及乙酸/丙酸随着精饲料添加比例升高呈升高趋势，这与易学武等[38]研究结果一致，可能在精饲料比例高的组合中，结构性碳水化合物含量低，非结构性碳水化合物含量高，而较高的非结构性碳水化合物被微生物快速降解，产生大量VFA，同时增加精饲料添加量引起体外发酵液环境改变，改变了微生物区系和微生物活性。
3.4 混合粗饲料和精饲料的不同组合比例对组合效应指数的影响单项组合效应指数根据实测值与加权估算值的差占加权估算值百分比得出，故不能解释为组合效应随实测值升高而上升，本试验也证实了该结论。同时，单凭一个指标很难准确评定饲料间利用率，只有将多项指标综合起来进行评价才会使结论准确度更高[39]。本试验中，50 : 50组综合组合效应指数值最大，20 : 80组负组合效应值最大，这可能由于精饲料中含有易发酵碳水化合物和CP含量较高能够快速分解生成大量VFA，破坏瘤胃内环境平衡，影响微生物分解活性，降低纤维素利用率和MCP合成。
4 结论本试验条件下，根据多项组合效应指数对玉米秸秆青贮+羊草+燕麦草与精饲料不同比例组合效应进行筛选得出，玉米秸秆青贮:羊草:燕麦草:精饲料为10 : 15 : 25 : 50时产生最大正组合效应。
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