联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对益生菌的定义为：一种当给予适当数量时对宿主健康有益的活的微生物^[1]。益生菌具有增强免疫功能、预防肿瘤和抗癌、改善肠道健康、吸附有害毒素、降低血清胆固醇含量等多个方面的功能^[2]，已经被广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康等领域。但大量使用益生菌活菌而引起的安全问题如细菌感染、产生有害代谢物、超敏反应等已经日益引起人们的关注^[3]。相较于活菌，灭活益生菌的安全性更高且在多个生理功能上同样具有有效性。目前，国内外灭活益生菌的研究主要集中在灭活乳杆菌属、灭活双歧杆菌属、灭活枯草杆菌以及一些灭活链球菌类^[4]。随着人们对益生菌研究的不断深入以及饲料行业减抗限抗的大势所向，灭活益生菌由于具有增强免疫、抑炎和黏附等生理功能，以及无害、无残留、货架期长等优势，在动物生产中具有良好的应用前景。但现阶段我国对灭活益生菌在畜牧行业的应用研究还较少，主要原因是对灭活益生菌的应用优势不够明确，对其主要的生理功能及作用机制尚不清晰，以及其在畜禽中的适宜添加量也不清楚。因此，本文旨在综述国内外灭活益生菌的研究进展，阐述其主要的生理功能及可能的作用机制，并综述了其在动物生产中的应用效果，以期为灭活益生菌的开发和利用奠定理论基础。

1 益生菌与灭活益生菌 1.1 益生菌的分类及灭活方法

益生菌可分为如下4类：1)乳酸菌。包括乳杆菌、双歧杆菌、链球菌等; 2)不产乳酸型细菌。包括芽胞杆菌、丙酸菌等; 3)非病原性酵母。包括酵母菌等; 4)无芽胞和无鞭毛的一类杆菌或球杆菌^[5]。在益生菌的众多种属中与动物关系最密切的是乳酸杆菌属、双歧杆菌属和肠球菌属。研究表明，在猪肠道中，乳酸杆菌在直肠中分布最多，双歧杆菌主要分布于回肠和盲肠，而肠球菌多分布在盲肠^[6-7]。在鸡小肠中，乳酸杆菌为优势菌群，在肠道的分布以盲肠最多，其次是空肠，十二指肠最少；肠球菌在各个肠段的分布较为均匀，从十二指肠到盲肠，有益菌总数逐渐增加^[8]。益生菌的灭活条件和方法通常会影响其作用效果^[9]。益生菌的灭活方法主要有：热灭活^[10]、γ-射线灭活^[11]、紫外线灭活^[12]、酸灭活^[13]、高压灭活^[14]、超声波灭活^[15]等。从成本、时间及生产工艺的繁杂程度考虑，热灭活是目前工业中生产灭活益生菌的常用方法。而Ouwehand等^[16]的研究则表明，紫外线灭活是研究灭活益生菌在不受灭活次生效应干扰的情况下最适宜的方法。

1.2 灭活益生菌的优势

从生产应用上看，灭活益生菌较益生菌活菌主要具有以下几个方面的优势：1)安全性高。Wagner等^[17]研究表明，益生菌活菌菌体的突变、非正常部位转移以及抗药性基因转移都可能会增加致病菌的危险，尤其对一些免疫力缺陷的病人而言，服用益生菌活菌很容易引起病理反应^[18]。相比较而言，灭活益生菌具有更高的安全性。2)用量易控制。Shah^[19]研究报道，使用益生菌活菌时，要获得预期的效果，其活菌数量必须达到一定水平，最低水平为每次摄取1×10⁹ CFU，以提供足够的活细胞在宿主肠道中定植^[20]，但过量添加又会引起一些不良反应；而灭活益生菌少量或适量添加均对机体有益，过量添加对机体影响也较小。3)稳定性高。灭活益生菌不需要维持一定的活菌数量，因此在运输、保存等方面较益生菌活菌更为容易，质量和稳定性也较高。4)可与其他添加剂合用。灭活益生菌可与其他添加剂合用，如抗生素、丁酸盐、活菌制剂等。而益生菌活菌在与其他添加剂使用时易产生敏感反应。5)抗逆性强。唾液、胃酸、胆汁、各种消化酶等均会影响益生菌活菌的使用效果，益生菌活菌在到达肠道的过程中，非芽孢杆菌类容易失活；而灭活益生菌是死菌，不受环境变化的影响，故能耐高温、胃酸、胆汁、消化酶、碱等，具有极强的抗逆性。6)不会导致噬菌体感染。由于灭活益生菌是死菌，不需繁殖，虽然可被噬菌体吸附，但不会被感染破坏。

2 灭活益生菌的生理功能及其作用机制 2.1 增强免疫和抗肿瘤

研究表明，灭活益生菌细胞壁组分中的肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸和DNA等成分免疫赋活作用的靶细胞主要是巨噬细胞，灭活益生菌通过激活巨噬细胞，使之分泌可溶性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)和干扰素-γ(IFN-γ)等功能因子，从而提高机体的非特异性免疫能力^[21]。其中，TNF-α和IFN-γ在预防肿瘤癌变中起着重要作用^[22]。Takahashi等^[23]研究表明，连续10 d给小鼠注射100 μg热灭活的干酪乳杆菌可以提高膀胱癌细胞周围细胞抗肿瘤细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达水平，显著降低小鼠膀胱癌细胞的生长速度，同时诱导嗜中性粒细胞向膀胱癌细胞的浸润。此外，IL-12和IFN-γ的合成能够进一步诱导T细胞向辅助性T细胞1(Th1细胞)转化，减少辅助性T细胞2(Th2细胞)的增殖和活化，以提高免疫器官的免疫机能^[24]。Matsuzaki等^[25]研究报道，口服0.05%灭活干酪乳杆菌激活了小鼠脾脏细胞和树突状细胞，产生了大量IL-12、IFN-γ，这显著增强了小鼠的体液免疫。Nomoto等^[26]研究发现，给接受了γ-射线辐射的大鼠灌服1%热灭活干酪乳杆菌，显著降低了大鼠死亡率，在辐射后使用的效果略弱于辐射前使用；进一步对接受辐射后大鼠使用热灭活干酪乳杆菌发现，大鼠体内外周血、脾脏和骨髓中粒细胞数量得到了加速恢复，免疫屏障得到了重建，抑制了骨髓坏死，从而使大鼠存活率得到了提高。另外，早期研究表明，抗菌肽是肠道黏膜天然免疫的重要成分，是先天抗微生物免疫的直接效应分子^[27]。而热灭活鼠李糖乳杆菌能促进鸡小肠上皮细胞抗菌肽β-防御素-9(AvBDA9)基因表达，且上调值显著高于活菌，表达量与时间存在依赖关系，在刺激12 h后表达量达到峰值^[28]。也有部分研究表明，灭活植物乳杆菌能够诱导动物机体内干扰素-β(IFN-β)的产生，增强机体抵抗力，预防H₁N₁、禽流感等病毒的侵袭^[29]，虽然其中机制尚不明确，但这可以为解决“非洲猪瘟”这个畜牧业难题提供一个重要的思路。总之，灭活益生菌主要是通过其细胞壁成分来发挥免疫调节作用，而部分研究却发现不同菌株在免疫功能的调节上存在差异，这可能是因为不同种类的菌株细胞壁成分的差异以及受体识别模式的不同导致的^[30]。

2.2 抑炎和缓解过敏

动物机体肠道内共生菌群之间的不当反应会导致肠道屏障受损，这也被认为是导致胃肠炎症发生的原因^[31]。一方面，灭活益生菌可通过依赖于髓样分化因子88(MyD88)的Toll样受体(TLR)信号通路，诱导紧密连接蛋白-3表达，加速促进肠道屏障细胞成熟，从而提高肠道屏障功能的完整性，以预防肠道炎症性疾病^[32]；另一方面，灭活益生菌细胞壁中的脂多糖和脂磷壁酸等成分能被细胞膜上的TLR特异性识别，并与白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK-1)结合，阻止IRAK-1的磷酸化，从而阻断了下游信号通路的激活，抑制了TLR介导的炎症反应^[33]。研究表明，鼠李糖杆菌的活菌和热灭活菌都可以通过TLR炎症信号通路，减少核因子-κB(NF-κB)的转导。虽然它们的作用机制不相同，但是结果都抑制了肠上皮细胞产生促炎因子白细胞介素-8(IL-8)，从而抑制了由病原体引起的过度炎症反应，减少了肠道黏膜损伤^[34]。且灭活状态下的鼠李糖杆菌的安全性更高，因为死菌避免了与其他肠道共生菌群过多的反应^[35]。

灭活益生菌还能够有效缓解动物的过敏反应^[36]。在动物生产过程中，抗生素的使用和疫苗的接种通常是过敏反应的诱发原因^[37]，这些过敏性疾病的特征是动物机体内血清免疫球蛋白E(IgE)含量迅速升高，而血清IgE含量升高通常被认为是Th1细胞和Th2细胞之间的比例失衡的结果。灭活益生菌可以通过改善Th1细胞与Th2细胞的平衡，使Th1细胞占主要优势，从而起到调节免疫、治疗过敏症状的作用^[38]。Matsuzaki等^[25]研究报道，口服灭活的干酪乳杆菌可以刺激大鼠免疫细胞分泌免疫细胞因子，显著减少IgE合成量，缓解过敏症状。此外，CD23是由白细胞介素-4(IL-4)诱导，受IFN-γ调控的IgE低亲和力受体，在过敏反应中，对IgE的合成起到重要促进作用。研究表明，热灭活嗜酸乳杆菌能够刺激巨噬细胞产生IFN-γ，阻止CD23 mRNA的表达，以抑制过敏反应^[39]。

2.3 黏附和黏附拮抗作用

灭活益生菌在抑制有害菌^[40-41]、改善肠道健康^[42]、吸附霉菌毒素^[43]等方面均具有有效性，这离不开它的黏附和黏附拮抗作用。黏附通常是病原菌入侵宿主的第1步，而益生菌可以通过黏附素与黏膜上皮细胞受体黏附，然后占位定植以阻止病原菌与黏膜受体结合产生黏附，以抵御外籍菌定植，从而起到占位性保护作用^[44]。灭活益生菌的黏附机理与活菌相似^[45]，且许多研究表明，灭活菌株的黏附和黏附拮抗作用还优于活菌^[40-41]。丁琴凤等^[46]研究表明，嗜酸乳杆菌的活菌和灭活菌对口腔牙龈上皮细胞的黏附以及对致病菌的黏附拮抗作用均有显著性差异，这说明了嗜酸乳杆菌本身代谢性生理活动对黏附作用影响较小，其机制更可能是通过其空间占位作用，与致病菌竞争共同黏附位点，从而减少致病菌对细胞的黏附和破坏。李亚杰等^[47]研究报道，热灭活的嗜酸乳杆菌可以通过黏附拮抗作用减少由大肠埃希菌的黏附作用所引起的腹泻，并且这种效果与灭活菌的用量存在依赖关系。这种黏附作用机制可叫作“占位性竞争抑制机制”。目前大部分学者认同的另一可能机制就是益生菌灭活时激活了细胞黏附相关物质的高表达，并且促进了细菌素、生物表面活性物质、过氧化氢等抗菌物质的分泌，从而表现出了较强的生物拮抗活性^[48-49]。

在吸附霉菌毒素方面，Wang等^[50]对6种热灭活乳酸菌进行不同处理，得出了影响灭活乳酸菌对展青霉素吸附的关键因素。分析表明，灭活乳酸菌的细胞组分中肽聚糖的物理结构并不是起吸附作用的主要因素，邻位羟基和羧基也不参与展青霉素的吸附，而碱性氨基酸、硫醇和酯类化合物对展青霉素的吸附起重要作用。并且，氢氧化钠和酯化预处理可显著提高吸附能力，而胰蛋白酶、脂肪酶、碘酸盐和高碘酸盐预处理可降低吸附能力。吸附能力在pH为2.2~4.0时基本保持不变，在pH为4.0~6.0时明显增强，当pH为4时，钠、镁离子吸附能力的影响较小。此外，除疏水相互作用外，静电相互作用也参与了展青霉素的吸附，这种作用随pH(4~6)的提高而增强。研究发现，在乳酸乳球菌的细胞外膜上由基因prtP编码的一种丝氨酸蛋白酶(lactocepin)能够介导乳酸菌对固体及液体表面的疏水性和附着力^[51]。对极性和非极性固体和溶剂的附着力的增加表明范德华力的作用可能介导了丝氨酸蛋白酶的黏附力。而基因prtP负责这些细胞表面的物理化学性质的变化，或其衍生物可以被用做一种工具，来构造压力增加黏附，形成生物保护膜^[52]。

3 灭活益生菌在动物生产中的应用 3.1 在家禽生产中的应用

在家禽饲粮中单独添加灭活益生菌或者配合其他添加剂使用，能改善家禽生长性能，提高免疫力。Zhang等^[53]研究表明，在肉鸡基础饲粮中分别添加0.010%、0.015%热灭活乳酸菌，能够显著增强肉鸡机体细胞免疫。这与付丽等^[54]研究结果一致，其研究结果表明在肉鸡饲粮中添加灭活乳酸菌培养物能够显著提高免疫器官指数，降低盲肠乳酸杆菌和大肠杆菌数量，提高肉鸡生长性能，并且试验发现可用0.16%灭活乳酸菌培养物替代0.01%金霉素的添加，从而获得更好的经济效果。研究报道，在雏鸡饲粮中添加0.05%的热灭活粪肠球菌干粉能够刺激仔鸡胃肠道免疫系统，加强机体的免疫反应，消解万古霉素耐药肠球菌的耐药性，并加速其在鸡肠道的排出^[55]。灭活益生菌还可与其他添加剂配伍使用，Zhang等^[56]在蛋鸡饲粮中单独添加400 g/t热灭活的唾液乳杆菌，显著提高了蛋鸡生长性能，并进一步在饲粮中添加400 g/t按照1:1比例配合的枯草芽孢杆菌活菌制剂和丁酸盐，结果发现，在提高蛋鸡的生长性能和蛋品质方面比起单独添加热灭活的唾液乳杆菌效果更显著。但目前，灭活益生菌与其他添加剂的协同作用的研究较少，故以复合形式添加时，灭活益生菌的适宜添加量还有待进一步研究。

3.2 在猪生产中的应用

饲粮添加灭活益生菌能够提高不同生长阶段猪的生长性能及免疫抗病能力。Ihara等^[57]研究发现，饲粮添加灭活的粪肠球菌会促使妊娠母猪机体内免疫球蛋白A(IgA)的分泌，提高母猪的免疫力，并且能使仔猪从母体中获得抗体含量较高的母乳，从而降低仔猪腹泻率。此外，研究表明，直接在仔猪饲粮中添加0.1%热灭活的粪肠球菌，能促进仔猪小肠绒毛的生长，提高动物机体对营养物质的消化吸收率，减少仔猪腹泻现象，从而提高仔猪的生长性能^[58]。Tsukahara等^[59]在生长猪饲粮中添加热灭活的粪肠球菌，降低了猪水肿病的发生率，且添加量为0.05%时效果最佳。Arimori等^[21]在10 kg断奶仔猪的基础饲粮中添加20 mg/kg的热灭活植物乳杆菌为试验Ⅰ组，基础饲粮中添加抗生素(30 mg/kg抗虫灵+10 mg/kg三肽霉素+20 mg/kg杆菌素)为试验Ⅱ组，结果显示，饲粮添加热灭活植物乳杆菌对猪的健康状况没有不良影响，试验Ⅰ、Ⅱ组的生长性能指标均显著高于对照组，且试验Ⅰ、Ⅱ组间无显著差异，试验Ⅰ组中性粒细胞数量以及中性粒细胞与淋巴细胞比率均高于试验Ⅱ组，这说明在提高猪的免疫能力方面，饲粮中添加灭活益生菌可能比添加抗生素效果更佳。

3.3 在其他动物生产中的应用

Hoseinifar等^[60]在白鲟饲料中添加2%的灭活啤酒酵母菌，提高了白鲟的生长性能，灭活益生菌通过“占位性竞争”抑制了有害菌的繁殖，改善了白鲟肠道健康。Dash等^[61]在淡水虾饲料中添加浓度为1.0×10⁸ CFU/g的热灭活植物乳杆菌，结果表明，淡水虾的免疫和抗病性能得到了显著提高。李桂英等^[62]在饲料中按1%添加热灭活的芽孢杆菌，提高了凡纳滨对虾非特异性免疫水平和抵抗疾病的能力。研究表明，热灭活的粪肠球菌可促进鱼类体内淋巴细胞CD4-1⁺、CD8α⁺和巨噬细胞的分泌，从而提高鱼类的免疫能力^[63]。Dawood等^[64]采用双因子交叉法，在真鲷饲料中分别添加0和1 g/kg的热灭活植物乳杆菌以及0.5和1.0 g/kg的维生素C，结果表明真鲷生长性能和抗逆能力显著提高，并指出灭活益生菌与维生素C在调节真鲷的生长性能、免疫系统、抗应激能力和降低血脂含量间存在协同作用，其作用机制尚不清楚。

4 小结及展望

综上所述，灭活益生菌具有增强免疫功能、抗肿瘤、抑炎和缓解过敏、黏附和黏附拮抗等多种生理功能。饲粮添加灭活益生菌能够改善动物肠道健康，提高动物生长性能和机体免疫力，或与其他添加剂如丁酸盐、维生素C等配伍使用时效果更佳。目前，灭活益生菌在饲料中的研究应用还相当缺乏，而减抗限抗是全球畜牧业发展的必然趋势，因此迫切需要进一步研究益生菌的灭活条件和生产工艺对其性能的具体影响，灭活益生菌与其他添加剂的互作效果和作用机制，以及不同动物各个生长阶段的适宜添加量，为灭活益生菌在动物生产中应用奠定理论基础。