磷是动物机体不可或缺的矿物元素[1]。对于肉用家禽，磷的作用更为重要。因此，需要在饲粮中添加无机矿物质磷来满足肉鸡的生长需要。但是，以植物性饲料为主的肉鸡饲粮中的磷大部分以植酸磷的形式存在，很大部分不能被机体吸收利用，未被利用的磷会随粪便排出体外，造成环境污染[2-3]。因此，在低磷状态下磷在小肠中的转运吸收分子机制还需要更深入的研究，这对于节约饲料资源并减少环境污染有重要意义。研究发现，十二指肠是磷吸收的主要场所，也是Ⅱb型钠磷协同转运载体(type Ⅱb sodium-phosphate cotransporter，NaPi-Ⅱb)表达的主要场所[4-5]。且肉鸡机体可通过调节十二指肠NaPi-Ⅱb、无机磷转运载体1(inorganic phosphate transporter 1，PiT-1)和无机磷转运载体2(inorganic phosphate transporter 2，PiT-2)的表达，来调节其对磷的吸收[4]。同时也有大量文献报道，低磷可促进肉鸡小肠NaPi-Ⅱb的表达[6-7]。本实验室张树敏[8]利用原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型，研究了不同磷浓度(0、6和48 mmol/L)下原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中相关磷转运载体(NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2)mRNA表达水平的变化，但其结果表明，该试验所设6和48 mmol/L的孵育液磷浓度过高，不能解释磷转运吸收提高的分子机制。因此，本试验在以上试验的基础上，通过研究低磷浓度下原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷吸收及相关磷转运载体的表达，揭示磷转运吸收的分子机制，并为后续小肠磷吸收分子机制研究中磷孵育浓度设置奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验采用单因子完全随机设计，在无磷基础液中以磷酸二氢钾(KH2PO4)形式设5个磷浓度，分别为0(对照组)、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L，共5个组，每个组6个重复。
1.2 试验动物18胚龄的爱拔益加(AA)肉鸡鸡胚购自河北滦平华都肉鸡公司。
1.3 孵育液的配制无磷基础液：参考Bobeck等[9]的方法，配制含137 mmol/L氯化钠(NaCl)、5.4 mmol/L氯化钾(KCl)、2.8 mmol/L氯化钙(CaCl2)、1.2 mmol/L硫酸镁(MgSO4)及14 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.4)的无磷基础液。过滤除菌，4 ℃保存备用。
含磷孵育液：在以上无磷基础液中以KH2PO4的形式添加不同浓度的磷，过滤除菌，4 ℃保存备用。
1.4 肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的原代培养参考张树敏等[10]消化、分离细胞的方法，进行肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的原代培养。
1.5 肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型的评估在细胞培养24和48 h，对细胞进行细胞跨膜电阻(TEER)值、酚红透过率以及培养液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性测定。
1.6 肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞不同浓度磷孵育液处理参考李晓丽[11]的方法，根据吸收模型的检测结果(见结果中肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型的评估)，细胞培养48 h后，弃去培养基，用37 ℃无磷基础液润洗几次，然后分别向各个组培养孔上池加入不同浓度磷的孵育液1.5 mL，下池加入无磷基础液2.6 mL，培养87 min后收样。
1.7 样品采集与制备磷孵育液的收集：孵育87 min时，将各组培养孔下池孵育液收集于离心管中，-20 ℃保存，以备测定其中磷含量。
NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2 mRNA以及翻译蛋白表达的细胞样品收集：孵育87 min时，立即将各培养孔上池中孵育液全部吸出，测定mRNA表达的细胞每孔加入0.5 mL预冷的Trizol，冰上裂解5 min；测定翻译蛋白表达的细胞每孔加入0.2 mL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解10 min。收样，于-80 ℃保存，以备后续测定NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2 mRNA以及翻译蛋白表达。
1.8 样品分析TEER值、酚红透过率、磷含量均参考张树敏[8]的方法进行测定。细胞培养液中LDH活性根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行测定。
采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析原代培养十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2的mRNA相对表达量[12-13]，所用引物均购于北京Invitrogen公司，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)与β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，用2-△△CT法计算以上3种目的基因的相对表达量。引物序列详细信息见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
采用Western blotting方法分析原代培养十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2翻译蛋白的相对表达量[14-15]。以GAPDH蛋白作为内参，分别计算以上3种目的蛋白的相对表达量。各蛋白的一抗来源及稀释倍数如下：GAPDH购自北京华兴博创基因技术有限公司，货号HX1828，稀释倍数1 : 5 000；NaPi-Ⅱb购自北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-0856R，稀释倍数1 : 2 000；PiT-1购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-98814，稀释倍数1 : 500；PiT-2购自英国Abcam公司，货号ab64412，稀释倍数1 : 5 000。
1.9 数据统计分析用SAS 9.2软件中一般线性模型[16]程序对所有数据进行单因素方差分析，差异显著者，以最小显著差数法(LSD)比较各平均值间的差异显著性。用不相关比较法分析各指标随磷添加水平的线性或二次曲线反应[17-19]。以每个重复分析样本作为1个试验单元。以P < 0.05作为数据差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型的评估由表 2可见，在细胞分别培养24和48 h时，TEER值均高于300 Ω·cm2，酚红透过率均小于5%，LDH活性处于较低水平。但48 h的TEER值与酚红透过率同24 h相比差异显著(P < 0.05)。因此，使用培养48 h细胞进行磷吸收率试验。
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表 2 不同培养时间点原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的TEER值、酚红透过率及LDH活性 Table 2 TEER value, phenol red transmittance and LDH activity in primarily cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos at different culture time (n=12) |
由表 3可见，随着磷浓度的增加，十二指肠上皮细胞中磷吸收率呈线性或二次曲线增加(P < 0.05)。
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表 3 不同磷浓度对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中磷吸收率的影响 Table 3 Effects of different phosphorus concentrations on phosphorus absorption percentage in primarily cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6) |
由表 4可见，十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb的mRNA相对表达量随着磷浓度的升高呈线性降低(P < 0.05)。与对照组相比，4.0 mmol/L组的十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb和PiT-1的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05)，而4.0 mmol/L组的十二指肠上皮细胞中PiT-2的mRNA相对表达量无显著变化(P＞0.05)。
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表 4 不同磷浓度对原代培养十二指肠上皮细胞NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2 mRNA表达的影响 Table 4 Effects of different phosphorus concentrations on NaPi-Ⅱb, PiT-1 and PiT-2 mRNA expression in primarily cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=5) |
由表 5可见，不同磷浓度对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达无显著影响(P＞0.05)。
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表 5 不同磷浓度对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠细胞中NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达的影响 Table 5 Effects of different phosphorus concentrations on NaPi-Ⅱb, PiT-1 and PiT-2 protein expression in primarily cultured duodenal epithelial cells of broiler embryos (n=6) |
细胞吸收模型是否建立成功通常通过细胞TEER值和酚红透过率的大小来判断。据文献报道，当TEER值大于300 Ω·cm2，酚红透过率小于5%时，即表明单层细胞吸收模型建立成功[20-22]。而LDH是在细胞浆内糖酵解过程中起催化作用的一种酶。在细胞培养过程中，如果细胞膜在外界环境的作用下受损破裂，它就会从细胞内漏出到细胞外的培养液中[23-24]。因此，LDH活性大小可以用来间接衡量细胞的活力。本试验中在细胞培养48 h时，细胞TEER值和酚红透过率比24 h更符合文献报道中的要求，且LDH活性处于较低水平，细胞状态良好，因此可以进行下一步的试验。
3.2 不同磷浓度对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷吸收率的影响曹满湖[25]研究发现，大鼠血清磷含量随着饲粮磷水平的升高而升高；也有研究表明，高磷可以显著上调蛋鸡血清中的磷含量[26]；同样地，本实验室前期在肉仔鸡的研究中也发现了此规律，但当饲粮非植酸磷水平升高到一定程度时，血清磷含量不再升高达到峰值[6-7]。徐运杰[27]通过外翻肠囊法研究发现，当培养液中的磷浓度在1.56~6.25 mmol/L时，肠囊的磷吸收与培养液中的磷含量呈正相关，但当磷浓度增加到12.00 mmol/L时，十二指肠肠囊的磷吸收量开始下降，磷吸收率与培养液中磷浓度呈负相关。张树敏[8]通过体外原代培养十二指肠上皮细胞的方法得出，十二指肠对磷的吸收率随着磷浓度的增加而增加；但当磷浓度升高至24 mmol/L时，磷吸收率出现平台，不再随磷浓度的升高而升高。本试验所得磷吸收特点与以上报道基本相似，可能是由于试验中所设磷浓度较低，最高为4.0 mmol/L，因此并未出现以上文献报道中所出现的平台。
3.3 不同磷浓度对原代培养十二指肠上皮细胞NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2 mRNA表达的影响目前已有大量文献表明，小肠中主要参与无机磷吸收的转运载体为NaPi-Ⅱb[28-31]，对于PiT-1和PiT-2与小肠磷吸收关系的研究还比较少。Liu等[32]研究发现，肉仔鸡十二指肠中NaPi-Ⅱb mRNA的表达随着灌注液中无机磷浓度的增加而显著降低；同样的，Hu等[33]研究发现，肉仔鸡十二指肠中NaPi-Ⅱb和PiT-1 mRNA的表达随着饲粮磷浓度的增加而显著降低；张树敏[8]用原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的方法发现，随着孵育液磷浓度的增加，十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb和PiT-1 mRNA的表达显著降低。本试验中，NaPi-Ⅱb和PiT-1 mRNA表达与上述报道一致，当磷浓度升高至4.0 mmol/L时，十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb和PiT-1的mRNA相对表达量显著降低，表明当磷浓度较高时，可通过抑制十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb和PiT-1 mRNA的表达，来调节对磷的吸收。大量研究表明，饲喂低磷饲粮可显著提高NaPi-Ⅱb mRNA的表达[6-7]，其原因可能是在低磷状态下，机体要通过上调NaPi-Ⅱb mRNA的表达来增加肠道对磷的吸收以满足机体的需要。与以上报道不同，本试验中较低浓度磷(0.5~2.0 mmol/L)处理对十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb的mRNA表达无显著影响，原因可能是由于在细胞培养模型构建时，培养液中的磷足够维持细胞自身的生长与代谢，所以使得细胞对试验中的低浓度磷反应不敏感。张树敏[8]和Hu等[33]的研究表明，原代培养鸡胚十二指肠上皮细胞或小肠的PiT-2 mRNA表达随磷浓度的升高而显著升高。本试验中，PiT-2 mRNA的表达与以上报道不一致的原因，可能是本试验中所设磷浓度比较低，使得PiT-2 mRNA的表达对磷浓度反应不敏感造成的。
3.4 不同磷浓度对原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达的影响有研究表明，低磷饲粮可以促进小鼠小肠NaPi-Ⅱb蛋白的表达[34]。在肉鸡的十二指肠中也发现了类似的规律，饲喂低磷饲粮同样可以促进肉鸡十二指肠NaPi-Ⅱb蛋白的表达[4]。胡义信[6]研究发现，随着磷浓度的升高，十二指肠中NaPi-Ⅱb和PiT-2的蛋白表达显著升高，而PiT-1的蛋白表达则显著降低。本试验中，NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达并不随磷浓度的变化而变化，其原因可能是研究方法不同造成的。张树敏[8]通过原代培养十二指肠上皮细胞方法的研究表明，与对照组相比，添加6 mmol/L的磷对肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达均无显著影响。本试验中，随着孵育液中磷浓度增加至4.0 mmol/L，肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaPi-Ⅱb、PiT-1和PiT-2蛋白表达无显著变化，本试验结果与张树敏[8]研究结果相一致。本研究中，磷转运载体的蛋白表达未出现变化的原因可能是由于在细胞培养模型构建时，培养液中的磷足够维持细胞自身的生长与代谢，从而不需要调节磷相关转运载体的蛋白表达来调节对磷的吸收；也可能是磷转运载体的蛋白表达相对于mRNA表达有所延迟。
4 结论随着孵育液磷浓度的增加，细胞磷吸收率增加；当孵育液中磷浓度为4.0 mmol/L时，原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞能通过下调NaPi-Ⅱb和PiT-1的mRNA表达来调节磷的吸收。
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