2. 海南大学热带农林学院, 儋州 571700
2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry Sciences, Hainan University, Danzhou 571700, China
随着人类对健康饮食的关注，消费者开始对富含生物活性化合物的畜产品越来越感兴趣[1-3]。在反刍动物采食的青绿饲料中有一些化合物，如叶绿素、叶黄素、胡萝卜素和一些脂肪酸等，它们具有抗氧化功能[4-5]，不仅对动物机体健康产生积极作用，而且对畜产品(如牛奶或牛肉)中功能性物质(如植烷酸、α-亚麻酸等)含量会产生直接影响[6-7]，进而提升畜产品价值。充分利用这些天然资源有助于提升粗饲料利用率，降低饲养成本。叶绿素分子由2部分组成，其核心部分是1个卟啉环，中心含有1个镁离子；另一部分是1个脂肪烃侧链，称为叶绿醇基，其游离态分子被称之为叶绿醇[8](图 1)。在饲喂反刍动物青绿饲料后，叶绿素分子中的叶绿醇基与瘤胃内微生物发生作用，代谢释放出植烷酸分子[9]。植烷酸作为一种天然的配体，是过氧化物酶活性受体的激活物，它不仅具有调节肝脏脂肪酸氧化等功能，还可以降低某些类型癌症的发生几率[10-11]，同时还具有缓解脂肪肝、糖尿病等功效[12]。在反刍动物产品中，植烷酸含量是判定功能性产品价值的重要指标[13]，因此，饲喂反刍动物叶绿素或叶绿醇含量较高的粗饲料将有助于生产出高品质畜产品[14]。
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图 1 叶绿素分子结构 Fig. 1 Chlorophyll molecular structure |
我国热带地区纬度低、光照强、牧草种类多、生物量大，这有助于高叶绿素含量牧草的生产[15]。王草[Pennisetum purpureum Schumacher×Pennisetum glaucum (Linnaeus) R. Brown]是我国热带普及率较高的牧草，也是热带反刍动物粗饲料的重要来源，对热带畜牧业的发展具有重要意义。由于海南岛平均降雨量高，致使王草生长迅速，若在草高2 m左右时进行刈割，每年可刈割8~10次[16]。由于王草营养价值变化难以通过其生育期判断，所以很多研究都通过王草的高度来反映它的成熟度和营养变化[16-18]。研究表明，植物中叶绿素的含量受牧草品种、施肥标准以及刈割阶段等影响[19]。此外，温度、日照、水分等对叶绿素的分解会产生影响。有研究表明，刈割后的黑麦草在自然干燥至水分含量为70%左右时，其叶绿素和叶绿醇含量没有显著下降，由此可见，高水分含量可以有效地减缓叶绿素的降解[20]。因此，叶绿素或叶绿醇资源在制作牧草青贮时可以被很好的保存。然而到目前为止，未见关于王草中叶绿素含量变动规律的相关报道，所以探明王草中叶绿素和叶绿醇含量的变动机制，对热带地区生产高品质畜产品具有积极意义。鉴于此，本试验拟探究不同刈割高度王草中叶绿素和叶绿醇含量在青贮前后的变动规律，并解析王草青贮中叶绿素和叶绿醇含量与发酵指标、常规营养成分含量之间的关系，旨在为王草在反刍动物生产中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 王草栽培与样品采集王草(热研4号)栽培于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所附属实验基地饲用王草栽培田(北纬195°109.5′，东经109°30′，海拔149 m)，自然条件下生长，试验田以充足水分灌溉。在试验田中划定4块试验区，每个区之间的直线距离在15 m以上，每个试验区平均分成4小区(共计16个小区)，分别于2018年2月28日(草高40~80 cm，T1)、3月16日(草高80~120 cm，T2)、3月29日(草高120~180 cm，T3)和4月23日(草高180~220 cm，T4)对4个试验区中的1个小区进行刈割(留茬高度约为5 cm)。首先对刈割的王草称重用于计算干物质(DM)生物量，再选定其中部分样品来测定茎叶比，然后将剩余样品切割至2 cm左右并混匀，在自然条件下风干1 d至水分含量为80%左右。取上述半干样品(水分含量约80%)约100 g保存于-20 ℃，用于叶绿素和叶绿醇含量分析，另取100 g样品65 ℃烘干，用于测定常规营养成分含量。
1.2 王草青贮制备在每个试验小区中，取200 g上述水分含量约为80%的王草样品装入30 cm×20 cm的聚乙烯青贮袋中，每个小区重复2次(共计32袋)，用真空打包机(Sinbo，上海)抽真空后密封，保存于暗室(室温25~30 ℃)储存发酵60 d后开封。开封后取约50 g样品保存于-20 ℃用于叶绿素和叶绿醇含量分析，另取50 g样品65 ℃干燥后用于测定常规营养成分含量。
1.3 样品分析 1.3.1 王草青贮发酵品质测定王草青贮开封后，取50 g样品，切碎后加入200 mL蒸馏水，使样品置于液面之下，密封后放入4 ℃冰箱静置保存24 h，之后用4层纱布将汁液过滤，用雷磁PHS-3C精密pH计测定滤液的pH[21]，然后将滤液倒入离心管，用离心机(Hermle，美国)离心，设定转速12 000 r/min，离心5 min后用1个0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶，用高效液相色谱(HPLC)仪分析乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。HPLC设定条件为：色谱柱为RP-18色谱柱(5 μm，4.6 mm×25.0 mm)，检测器为日立Primaide型紫外检测器，流动相为甲醇，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm，进样体积为10 μL。
青贮中挥发性盐基氮(VBN)的含量用微量扩散法分析。取1个康卫皿，在内皿加入1 mL硼酸指示剂(含有硼酸、甲基红、溴甲酚绿的乙醇溶液)，外皿加入1 mL离心后的青贮汁液和饱和碳酸钾(K2CO3)溶液(浓度为52.5%)，盖盖密封，使外皿的青贮汁液和碳酸钾溶液充分混合，保持挥发状态，静置24 h后，用滴定盐酸(0.01 mol/L)滴定[22]。
1.3.2 常规营养成分含量测定自然风干的王草和青贮王草中的DM、粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)和粗灰分(Ash)含量的测定参照AOAC(1999)[23]的方法进行；中性洗涤纤维(NDF)含量的测定按照Van Soest等[24]的方法进行；非纤维性碳水化合物(NFC)含量的计算方法参照NRC(2001)[25]进行，计算公式为：
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参照Porra等[26]的方法对青贮前后王草中叶绿素含量进行测定，具体操作如下：将冷冻的样品取出，用冷冻干燥机(Labconco，美国)冷冻干燥72 h，充分研磨后，取样品约50 mg，装入50 mL离心管，并加入30 mL 80%丙酮水溶液，密封避光冷藏静置24 h后，用分光光度计(岛津，UV 2600，日本)分别在波长663.6和646.6 nm处测定吸光度(分别记为A663.6和A646.6)，计算叶绿素a和叶绿素b含量，二者之和则为叶绿素含量。为反映出叶绿素与叶绿醇之间的关系，探明叶绿醇分子是否全部来源于叶绿素分子，将叶绿素和叶绿醇含量单位换算成摩尔含量后进行比较。
计算方法如下：
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参照Lv等[19]的方法对青贮前后王草中叶绿醇含量进行测定，具体操作如下：将上述30 mL的提取液加入1 mL的1-十九烷醇内标液(0.25 mg/mL)，充分混合，用于提取叶绿醇。采用配备Rxi-5毛细管柱(长度30 m，内径0.25 mm，薄膜厚度0.25 mm；Restec，美国)的气相色谱仪(GC-7890A；Agilent Techonlogies，美国)进行测定，分析条件如下：喷油器温度为250 ℃，检测器温度为340 ℃，气体压力为90 kPa，柱气流量为1.05 mL/min。温度程序如下：60 ℃持续1 min，然后以30 ℃/min的速度增加到160 ℃，然后以5 ℃/min的速度增加到240 ℃，最后以20 ℃/min的速度增加到320 ℃。
1.4 统计分析试验数据采用SAS 9.2软件[27]进行统计分析，王草青贮前后常规营养成分、叶绿素、叶绿醇含量和王草青贮发酵指标采用单因素方差分析进行分析，以P < 0.05作为差异显著性标准。采用Excel 2013分析王草青贮中叶绿素和叶绿醇含量与发酵指标、常规营养成分含量之间的关系。
2 结果与分析 2.1 不同刈割高度王草的DM生物量和茎叶比的比较由表 1可知，在4个刈割高度(T1~T4)下，王草的DM生物量随着刈割高度的增加显著升高(P < 0.05)，茎叶比在T1~T4组分别为1.37、0.85、0.69和0.46，随着刈割高度的增加呈显著降低(P < 0.05)。
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表 1 不同刈割高度王草的干物质生物量和茎叶比的比较 Table 1 Comparation of DM biomass and leaf-to-stem ratio of king grass at different harvesting height heights |
表 2揭示了不同刈割高度王草中常规营养成分、叶绿素和叶绿醇含量的变化。在4个刈割高度(T1~T4)下，王草中CP和Ash含量随着刈割高度的增加显著降低(P < 0.05)，NDF和NFC含量随着刈割高度的增加而显著增加(P < 0.05)，EE含量在T1组显著高于其他组(P < 0.05)，T2和T3组之间没有显著差异(P>0.05)。在半干王草(水分含量约为80%)中，叶绿素a和叶绿素b含量随着刈割高度的增加而显著降低(P < 0.05)，叶绿素和叶绿醇含量也表现出了相同的变化趋势。
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表 2 不同刈割高度王草中常规营养成分、叶绿素和叶绿醇含量的比较 Table 2 Comparation of the contents of common nutrients, chlorophyll and phytol in king grass at different harvesting heights |
表 3揭示了不同刈割高度王草青贮中常规营养成分、叶绿素和叶绿醇含量的变化。青贮60 d后，王草青贮中CP、NDF、EE和Ash量随着刈割高度的增加的变化趋势与半干王草(水分含量约为80%)中它们含量的变化趋势相同。此外，在青贮后王草中叶绿素大部分被分解，其含量较青贮前明显降低，但残留的叶绿素仍然受到刈割高度的影响，王草青贮中叶绿素a、叶绿素b和叶绿素含量均随着刈割高度的增加显著降低(P < 0.05)。在青贮后王草中叶绿醇含量变动不大，在4个刈割高度王草青贮中的含量分别为3.04、1.75、1.62和1.36 g/kg DM，随着刈割高度的增加显著降低(P < 0.05)，与原料草(水分含量约为80%的半干王草)中叶绿醇含量的变化趋势相同。
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表 3 不同刈割高度王草青贮中常规营养成分、叶绿素和叶绿醇含量变动的比较 Table 3 Comparation of the contents of common nutrients, chlorophyll and phytol in king grass silage at different harvesting heights |
根据王草和王草青贮中叶绿素和叶绿醇含量计算出了王草和王草青贮中叶绿素和叶绿醇的摩尔含量，列于表 4。通过计算可知，青贮后，4个刈割高度的王草中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素的分解率分别约为70%、90%、74%；然而，在T1~T4组中，王草青贮前后的叶绿醇含量比值分别为0.97、0.92、1.07和1.15，并且组间没有显著差异(P>0.05)，这证明了叶绿醇可以在青贮过程中被较好地保存。
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表 4 不同刈割高度王草青贮前后叶绿素和叶绿醇含量变动的比较 Table 4 Comparation of the changes of chlorophyll and phytol contents in king grass at different harvesting heights before and after ensiling |
表 5显示了不同刈割高度王草青贮的发酵指标。T1、T2、T4组的乳酸含量没有显著差异(P>0.05)，但T1组的乙酸含量显著高于其他组(P < 0.05)。T3组中产生了最多的乳酸(3.46 g/kg DM)、最少的乙酸(0.61 g/kg DM)和最低的pH(3.62)，表现了优异的发酵品质。对数据进一步分析后发现，王草青贮中叶绿醇含量与CP含量呈显著的正相关关系(R2=0.74，图 2)，叶绿素和叶绿醇含量与发酵指标(pH、挥发性脂肪酸与挥发性盐基氮含量)没有统计学关联(R2均小于0.4，表 6)。
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表 5 不同刈割高度王草青贮的发酵指标 Table 5 Fermentation indexes of king grass silage at different harvesting heights |
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图 2 青王草贮中粗蛋白质与叶绿醇含量的关系 Fig. 2 Relationship between crude protein and chlorophyll content in king grass silage |
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表 6 王草青贮中叶绿素和叶绿醇含量与青贮发酵指标的相关系数 Table 6 Correlation coefficients between chlorophyll and phytol contents and fermentation indexes in king grass silage |
王草是海南地区的重要饲料作物，具有生长迅速、产量大、易青贮等特征[28]。本试验中我们测量了4个刈割高度王草的DM生物量，发现此生物量与曹启民等[29]的调查结果相近。根据叶绿素含量，计算出4个刈割高度王草叶绿素产量分别是52.1、57.2、63.1和50.7 kg/ha DM。尽管T1组中王草叶绿素含量较高，但叶绿素产量却是T3组最高，而且该组王草CP和NDF含量也较高，综合评定其常规营养成分、叶绿素含量和DM生物量，发现在120~180 cm高度(T3组)下刈割王草具有更高的饲用价值。在T4组中，叶绿素含量表现为最低，叶绿素的主要由土壤中的氮和磷P元素合成[30-31]，但土壤中的氮元素有限，可能在草高180 cm以上时没有充足的氮源再进一步合成叶绿素，因此，在未来研究中，有必要结合土壤养分和光照数据进一步探讨。
本试验结果表明王草刈割高度显著影响了其常规营养成分、叶绿素和叶绿醇含量，这个结论在其他研究[19, 32]中已得到验证。Lv等[19]对黑麦草中叶绿素含量进行了检测，但无论早期刈割(草高约40 cm)还是晚期刈割(草高70~80 cm)，其含量都显著低于草高40~80 cm王草。尽管二者栽培条件不同，但这也可以间接证明热带地区低纬度环境有助于牧草合成叶绿素[15]。研究发现，在相同刈割高度条件下，王草中叶绿素含量为黑麦草中的2倍以上[20]。随着刈割高度的不断增加，王草中叶绿素的含量逐渐降低，相比T1组，T4组王草中叶绿素和叶绿醇含量降低了2倍以上，可见刈割高度对叶绿素和叶绿醇含量的影响是较大的。研究表明，植物色素主要存在于植物叶片中[33-34]，本试验也检测了不同刈割高度王草在DM基础上的茎叶比，即叶/茎，这间接反映了王草中叶绿素含量的变动规律(表 1)，即：随着王草刈割高度的增加，叶片比例逐渐降低，王草植株单位叶绿素含量被稀释。经过60 d的青贮，所有的发酵袋均没有发生破损情况。随着王草刈割高度的增加，王草青贮中常规营养成分含量的变化趋势与半干王草(水分含量约为80%)相同，但是CP和NDF含量相比半干王草(水分含量约为80%)有降低趋势，这可能是由于本试验中王草水分含量较高，使一些营养成分伴随发酵汁液流失[35]。在不同刈割高度的王草青贮中，叶绿素大部分被分解，残留的叶绿素也受到刈割高度的影响，即随着刈割高度的增加而显著降低。在T1~T4组王草的青贮过程中，叶绿素的分解率几乎相同(表 4)。通过计算，王草青贮后，约有74%的叶绿素被分解，但是黑麦草青贮则约为80%(青贮方法与保存方法与本试验相同)[19]，由此可见，不同牧草品种影响叶绿素的分解程度；此外，本试验结果显示了在王草青贮中有少量叶绿素b存在，但在黑麦草青贮中几乎检测不到叶绿素b[19]。王草青贮中叶绿醇含量与半干王草(水分含量约为80%)相近(表 3、表 4)，可见王草中叶绿醇在青贮过程中被完好的保存，这个现象也与本课题组之前的研究结果[19]相同。Lv等[19]研究发现，在黑麦草中，叶绿醇含量高于叶绿素含量，这可能是由于部分叶绿醇分子来自叶绿素以外的某些长链脂肪酸[36]。但是在本研究中，我们无法确定这一现象，这或许也和牧草的品种、脂肪酸组成等有关。此外，王草青贮中叶绿醇含量与CP含量呈现了线性关系(y=0.024 9x-2.222 4，R2=0.74；图 2)，因此，可以通过王草青贮中CP含量而间接推测其叶绿醇含量，这个现象与Lv等[19]研究结果基本一致。
多个研究已表明不同刈割高度牧草青贮具有不同的发酵品质[37-38]。本研究结果表明，不同的刈割高度导致了王草中NFC含量的差异，进而导致王草青贮中有机酸含量的不同。在不同刈割高度的4个组中，以T3组乳酸含量最高，乙酸含量最低，呈现了最好的发酵品质(表 5)，这与张英等[39]的研究结果相同；此外，乳酸含量增加可有效降低pH[40]，这在本试验中也得到再次验证。T1组中乙酸含量最高，但并不清楚这一现象的原因，我们猜测可能是由于原料草较高水分含量和较早生育期共同作用的结果，在下一步研究中，将继续观察该现象。尽管不同的刈割高度导致了王草发酵品质(挥发性脂肪酸和挥发性盐基氮含量)存在较为明显的差异，但是经过统计分析后，没有观察到其含量变动与叶绿醇保存、叶绿素分解之间的统计学关系，因此，发酵品质可能并不影响叶绿素在青贮过程中的变化。
4 结论王草中叶绿素和叶绿醇含量随着刈割高度的增加而显著降低；在青贮后，王草中约有74%的叶绿素被分解，但叶绿醇则在青贮过程中被良好保存；此外，王草青贮中叶绿素与叶绿醇含量与发酵品质没有显著相关性，但叶绿醇含量与CP含量呈正相关。
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