L-瓜氨酸(L-citrulline，L-Cit)是机体氮素循环的重要参与者和中间代谢产物^[1]，首次从西瓜中分离获取^[2]。L-瓜氨酸与L-精氨酸、L-鸟氨酸协同作用，发挥重要的生物学作用。研究显示，L-瓜氨酸在清除自由基、抗氧化、提高免疫力、调节血压、维持血糖水平、调控胆固醇及松弛血管等方面有显著作用^[3-8]。L-瓜氨酸作为精氨酸的前体物质，通过代谢被小肠吸收，转运至肾脏合成精氨酸，从而进一步调控机体及血浆精氨酸的水平。董晓丽等^[9]研究发现，随着肉鸡饲粮精氨酸比例的升高，平均日增重呈显著的二次曲线增加。赵红霞等^[10]研究结果显示，饲料中添加2.64%和2.81%的精氨酸能够显著提高黄颡鱼幼鱼的增重率。孙召君^[11]研究结果显示，哺乳仔猪饲粮中添加L-瓜氨酸能够显著增加仔猪的平均日增重。目前，关于L-瓜氨酸的研究主要集中在提取、合成及测定等方面，特别是细菌代谢分离产生L-瓜氨酸的研究，如钝齿棒杆菌、谷氨酸棒杆菌及粪肠球菌等都是分离产生L-瓜氨酸的高效菌种^[12-14]。L-瓜氨酸合成、分解、代谢主要发生于肠道，然而关于其对肠道代谢及肠道细菌调控方面的研究鲜见报道。因此，本试验以小鼠为研究对象，通过灌喂外源性L-瓜氨酸探究其对小鼠体重及肠道菌群多样性的影响，为进一步提高L-瓜氨酸的生物学价值及科学使用提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计及饲养管理

试验选择20日龄、平均体重(14.66±0.28) g的昆明小白鼠公鼠32只，随机分为2组，每组8个重复，每个重复2只。在相同的饲养条件和饲粮营养水平下，试验组小鼠灌胃1 mL/(d·只)1%的L-瓜氨酸(购自华恒科技生物有限公司，纯度≥98.5%)，分别在10:00和18:00分2次灌胃，每次灌胃0.5 mL；对照组小鼠相同时间灌胃等量的蒸馏水。试验期21 d。

试验期间每2只小鼠在1个鼠笼里饲养，每3 d换1次垫料，每天09:00和20:00各饲喂1次，自由饮水，试验开始的前1天和结束的当天称取小鼠体重，试验第21天断颈处死全部小鼠，采集小鼠盲肠内容物。饲粮组成及营养水平见表 1。

1.2 样品采集与指标测定 1.2.1 体重

在试验开始的前1天和第21天，分别称取小鼠体重数据，用于分析小鼠体重增长情况。

1.2.2 盲肠内容物

在试验第21天，将所有小鼠断颈处死，采集小鼠盲肠内容物，每个重复2只小鼠的样品合为1个样品，用无菌冻存管分装，-20 ℃冷冻保存，第2天送检，用于分析肠道菌群多样性。

1.3 样品测定

总DNA提取、PCR扩增和Illumina HiSeq测序及结果分析均委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。

1.4 数据处理

体重数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS 18.0软件进行独立样本t检验。肠道菌群多样性数据采用Metastats分析使用R软件在各分类水平下做组间的置换检验(permutation test)，得到P值，然后利用Benjamini and Hochberg False DiscoveryRate方法对于P值进行修正，组间差异显著的物种分析利用R软件做组间t检验。

2 结果 2.1 L-瓜氨酸对小鼠体重增长的影响

由表 2可知，L-瓜氨酸对小鼠的末重、总增重及平均日增重有显著影响(P＜0.05)。试验组小鼠末重比对照组提高了29.35%(P=0.022)，总增重比对照组提高了32.29%(P=0.046)，平均日增重比对照组提高了32.28%(P=0.048)。

2.2 L-瓜氨酸对小鼠肠道菌群多样性的影响 2.2.1 小鼠肠道菌群门水平丰度变化

由表 3可知，小鼠肠道门水平优势菌群分别是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、未确认细菌(unidentified_Bacteria)、疣微菌门、Melainabacteria、软壁菌门、梭杆菌门及迷踪菌门。其中60%以上为厚壁菌门，其次是变形菌门、拟杆菌门、放线菌门。L-瓜氨酸对小鼠肠道菌群门水平丰度无显著影响(P＞0.05)，但是能够增加拟杆菌门(P=0.21)、放线菌门(P=0.65)、疣微菌门(P=0.18)、Melainabacteria(P=0.42)及软壁菌门(P=0.37)的丰度，抑制厚壁菌门的丰度(P=0.67)。

2.2.2 小鼠肠道菌群科水平丰度变化

由表 4可知，小鼠肠道科水平优势菌群分别是乳杆菌科、胞菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科、Unidentified_Clostridiales、Eggerthellaceae、Muribaculaceae、脱疏弧菌科、unidentified_Bacteria及类杆菌科。与对照组相比，L-瓜氨酸能增加小鼠肠道毛螺菌科(P=0.40)、瘤胃菌科(P=0.40)、Unidentified_Clostridiales(P=0.51)、Eggerthellaceae(P=0.67)、Muribaculaceae(P=0.14)、脱疏弧菌科(P=0.33)及类杆菌科(P=0.20)的丰度。

2.2.3 小鼠肠道菌群属水平丰度变化

由表 5可知，小鼠肠道属水平优势菌群分别是乳杆菌属、寡养单胞菌、分节丝状菌、Candidatus_Saccharimonas、拟杆菌属、Enterorhabdus、脱硫弧菌、Unidentified_Ruminococcaceae、Phyllobacterium及Allobaculum。与对照组相比，L-瓜氨酸能够增加分节丝状菌、Candidatus_Saccharimonas、拟杆菌属、Enterorhabdus、脱硫弧菌、Unidentified_Ruminococcaceae、Phyllobacterium及Allobaculum的丰度，但是差异不显著(P＞0.05)。

2.2.4 小鼠肠道菌群种水平丰度变化

由表 6可知，小鼠肠道菌群种水平优势菌群分别是罗伊氏乳杆菌、肠乳杆菌、生酸拟杆菌、黄化瘤胃球菌、Bacteroides_sartorii、Ruminococcus_sp_ID1、Bacteroides_vulgatus、Helicobacter_ganmani、Parabacteroides_distasonis及Trichinella_pseudospiralis。与对照组相比，L-瓜氨酸能够增加生酸拟杆菌、黄化瘤胃球菌、Bacteroides_sartorii、Ruminococcus_sp_ID1及Bacteroides_vulgatus丰度，但是差异不显著(P＞0.05)。

3 讨论

瓜氨酸是L-精氨酸的前体物质，主要的合成位点在小肠，精氨酸在鸟氨酸转氨酶及鸟氨酸转氨甲酞酶逐步作用下产生瓜氨酸^[15]，这种转化率随动物年龄的增长呈现波动变化。小肠中生成的瓜氨酸在精氨基琥珀酸合成酶和精氨基琥珀酸裂解酶作用下在肾脏中进一步完成精氨酸的合成^[16]。小肠瓜氨酸合成量影响精氨酸的内源性合成，酶抑制试验或者小肠切除试验结果显示，小肠瓜氨酸的合成受阻，并出现精氨酸缺乏现象^[17]。在促进动物生长方面的研究显示，饲粮中添加不同剂量的瓜氨酸能够显著增加肉鸡、黄颡鱼幼鱼、小鼠及肉兔的体重^{[9-10, 18]}。孙召君^[11]研究显示，哺乳仔猪饲粮中每天添加290 mg/kg BW的L-瓜氨酸，能够增加仔猪7~21日龄的平均日增重。一方面瓜氨酸能够促进体重增长和促进内分泌激素释放有关，研究显示，瓜氨酸可以促进生长激素、胰岛素和胰高血糖素等激素的分泌^[19]；另一方面可能与瓜氨酸转化生成精氨酸有关。

体重增长受多种因素影响，包括遗传、品种、疾病、饲粮结构、饲养管理方式及环境温湿度等。L-精氨酸对热暴露小鼠肝脏的保护作用机制试验结果显示，灌喂L-精氨酸可以显著增加小鼠的体重^[20]。本试验结果显示，灌喂L-瓜氨酸能够显著增加小鼠体重增长，试验组小鼠末重比对照组提高了29.35%，总增重比对照组提高了32.29%，平均日增重比对照组提高了32.28%，与孙召君^[11]的研究结果一致，说明L-瓜氨酸能够促进体重的增长。目前L-瓜氨酸对调控小鼠体重增长的机制尚不明确，可能与L-瓜氨酸转化为L-精氨酸对肠道起保护作用有关^[21-22]。胃肠道的健康直接影响机体对营养物质的消化吸收，从而影响到动物生长发育。此外，研究显示一氧化氮是精氨酸在一氧化氮合成酶的作用下合成的细胞舒张因子之一。一氧化氮在维持细胞正常功能^[23-24]，抑制白细胞黏附及白细胞渗出，维持血细胞和血浆蛋白的渗透压屏障，维持血管舒张状态及营养物质代谢，特别是糖、脂肪、蛋白质及氨基酸的代谢中发挥重要作用^[25]。瓜氨酸-一氧化氮循环是细胞内维持精氨酸补充与瓜氨酸处于动态平衡的途径^[26]。因此，瓜氨酸的灌喂可能促进了一氧化氮的代谢，增加机体营养物质的输送，是促进小鼠体重增长的另一因素^[27]。

肠道菌群是动物胃肠道中的家庭成员之一，种类丰富，数量庞大。这些菌群与肠道内容物、肠道组织构建成一个复杂而稳衡的动态关系，共同维持肠道发育、肠道健康，对动物的生长发育意义重大。例如，单胃动物盲肠或结肠中细菌，可以降解饲粮碳水化合物，产生丰富的乙酸、丙酸及丁酸等，这些脂肪酸不仅提供满足动物需要的能量，同时可以维持肠道酸碱平衡，维持肠道健康，促进有益菌的生长，抑制有害菌的增殖。此外，正常菌群在动物免疫系统中充当重要的调节者，不仅能够促进幼龄动物免疫系统的发育，而且还是动物体重要的非炎症反应免疫刺激原。研究显示，补喂瓜氨酸可以降低大鼠结肠组织炎症反应，对结肠有保护作用，并且能够降低结肠炎症因子水平^[28]。肠道健康决定了动物生长发育及健康，而菌群的种类、丰度发挥关键作用。因此，丰富动物肠道菌群丰度和结构，对动物肠道健康意义重大。

祁玉丽等^[29]、赵菲等^[30]研究结果显示，正常情况下厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门是小鼠肠道的主要菌群，其中厚壁菌门占比最多，其次是拟杆菌门和变形菌门等，而肠道中总丰度90%以上的细菌都由这几种菌构成。本试验结果显示，门水平排在前10的优势菌中，灌喂L-瓜氨酸可以增加拟杆菌门、放线菌门、疣微菌门、Melainabacteria及软壁菌门的丰度；在科水平上，灌喂L-瓜氨酸增加了毛螺菌科、瘤胃菌科、Eggerthellaceae、Muribaculaceae、脱疏弧菌科及类杆菌的丰度；在属水平上，灌喂L-瓜氨酸增加了分节丝状菌、拟杆菌属、Enterorhabdus、脱硫弧菌及Allobaculum的丰度；在种水平上，灌喂L-瓜氨酸增加了生酸拟杆菌、黄化瘤胃球菌、Bacteroides_sartorii、Ruminococcus_sp_ID1及Bacteroides_vulgatus的丰度。由此可见，给小鼠灌喂L-瓜氨酸能够增加小鼠盲肠优势菌群的丰度，丰富小鼠肠道细菌的数量。这些细菌丰度的增加丰富了小鼠盲肠菌群的多样性，改变了盲肠菌群结构。厚壁菌门和拟杆菌门是小鼠肠道中绝对的优势菌群，肠道中绝大部分有益菌都隶属于这两大菌门^[31]。大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺旋杆菌等病原菌属于变形菌门，这类细菌是易引起动物腹泻的主要菌^[32]，在糖代谢、脂代谢中，特别是碳水化合物分解方面厚壁菌门和拟杆菌门扮演者重要角色，对于维持肠道稳态和健康发挥重要作用^[33]。本试验中，灌喂L-瓜氨酸有增加拟杆菌门等优势菌门丰度的趋势，说明L-瓜氨酸能够促进肠道有益菌的数量增加，维持肠道健康。

4 结论

在本试验条件下，灌喂L-瓜氨酸能够增加小鼠的末重、总增重及平均日增重，改变小鼠盲肠门水平菌群组成，增加拟杆菌门、放线菌门、疣微菌门及软壁菌门的丰度。