粗饲料是肉牛饲粮中重要的组成部分，一般占饲粮的60%~80%。动物采食饲粮后，瘤胃微生物黏附在饲料碎片上，通过物理、化学等手段对其降解，生成挥发性脂肪酸(VFA)、二氧化碳(CO₂)和甲烷(CH₄)等，为机体生长、发育等提供所需营养素^[1]。我国南方地区气候高湿多雨，不适宜种植苜蓿、羊草等，但是象草不仅可以在亚热带、热带地区种植，而且还具有产量高及粗蛋白质、无氮浸出物含量高等特点，因此南方地区的肉牛养殖场常大面积种植象草饲喂动物^[2]。湖南洞庭湖区为芦笋生产区，在制作芦笋食品的过程中而剥除的芦笋皮常被当作垃圾丢弃，不仅是资源的浪费，也对环境造成了一定的污染。王郝为等^[3]分析表明，芦笋皮具有营养全面、蛋白质含量高(14.53%)、相对饲用价值高(151.89%)等特点，是一种优质的粗饲料。而且，研究还发现芦笋皮中富含黄酮类物质，具有抗氧化、抗菌消炎等作用^[4-5]。

代谢组学技术可以对动物机体代谢生成的小分子代谢物及其相关代谢途径分析，系统阐述生物机体的营养代谢变化，从而评价动物机体对饲料原料或饲粮的代谢过程^[6]。肖英平^[7]利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术考察了早期断奶仔猪饲粮中添加谷氨酰胺对血清代谢物的影响，结果发现饲粮中添加谷氨酰胺提高了仔猪血清中肌酐、D-木糖、2-羟丁酸、反式-9-十六烯酸和α-L-呋喃半乳糖的含量，改善了仔猪物质代谢过程。利用芦笋皮作为粗饲料饲养肉牛并研究其对血清代谢物影响的添加目前尚未见报道。因此，本试验以安格斯肉牛为试验动物，基于代谢组学技术研究芦笋皮饲粮或象草饲粮对肉牛血清代谢物的影响，以期为芦笋皮的饲料化开发利用提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

芦笋皮(风干样中粗蛋白质含量为14.53%，粗脂肪含量为2.51%，中性洗涤纤维含量为42.98%，酸性洗涤纤维含量为20.87%，总能为16.99 MJ/kg)为芦笋加工采摘中间食用部分的副产物，产地为湖南省沅江市南大镇。象草为牛场自种饲草。

1.2 试验设计及饲养管理

选用10头8月龄、体重(236.50±34.00) kg的健康安格斯肉牛，由湖南省沅江市鑫达林牧科技发展有限公司提供。根据单因子完全随机设计，随机分为2组，每组5个重复，每个重复1头肉牛，单栏饲养。各组肉牛分别饲喂芦笋皮饲粮(A组)和象草饲粮(B组)，试验饲粮参考NRC(2000)肉牛营养需要配制，其组成及营养水平见表 1。饲粮均制成全混合日粮(TMR)，按照1.3倍的营养需要供给，每天饲喂2次(08：00和18：00)，自由饮水。预试期15 d，正试期45 d。

1.3 指标测定 1.3.1 饲粮营养水平测定

试验结束前连续3 d采集饲粮样品，备分析饲粮营养水平用。饲粮于60 ℃条件下烘48 h，粉碎，过1 mm筛。粗蛋白质含量利用全自动凯氏定氮仪(海能K1100F，济南海能仪器股份有限公司)，参照国家标准(GB/T 6432—2018)^[9]测定；粗脂肪含量利用全自动脂肪测定仪(海能SOX500，济南海能仪器股份有限公司)，参照国家标准(GB/T 6433—2006)^[10]测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量利用全自动纤维分析仪(海能F600，济南海能仪器股份有限公司)，参考张崇玉等^[11]的方法测定。

1.3.2 血清代谢物测定

试验最后1天，晨饲前利用真空采血管采集肉牛尾静脉血，每头采集5 mL，静置30 min，2 000×g离心10 min，取血清，迅速液氮冷冻，送至实验室，-80 ℃保存，备血清代谢物测定。将血清样品解冻，取100 μL样品与甲醇(0.35 mL)、L-2-氯苯丙氨酸(20 μL)混合，漩涡10 s混匀；4 ℃条件下，10 000×g离心15 min，取0.4 mL上清进行代谢物衍生化，待气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOFMS)分析。仪器为：气相色谱(Agilent 7890B，Agilent，美国)-飞行时间质谱仪(LECO Chroma TOF PEGASUS HT，LECO，美国)，配有Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm, J & W Scientific, Folsom，美国)。具体条件为：不分流模式，1 μL进样量；柱温为50 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速率上升至310 ℃，保持6 min；前进样口温度为280 ℃，离子源温度为220 ℃，扫描速率为20 spectra/s，溶剂延迟4.75 min，氦气为载气，参考Kin等^[12]和Dunn等^[13]方法进行血清代谢物检测。

1.4 数据统计

首先，对获得的原始数据进行过滤以去除噪声数据，归一化处理。然后，利用SIMCA软件(V14.1, MKS Data Analytics Solutions，Umea，瑞典)进行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，考察2组肉牛血清代谢轮廓的总体差异，鉴定组间差异代谢物。OPLS-DA中变量投影重要度(variable importance in projection，VIP)大于1的变量被认为差异变量。

使用多元变量统计分析(multi-and megavariate data analysis)方法进行差异代谢物的筛选(VIP>1，P＜0.10)，并进行差异代谢物的定量值计算欧式距离矩阵(euclidean distance matrix)，利用完全连锁方法对差异代谢物进行聚类，以热力图展示。将所有的代谢物在KEGG PATHWAY数据库对物种牛(Bos taurus)进行映射，结合数据库的富集分析和拓扑分析，鉴别出2组肉牛血清中表现差异相关性最高的关键通路。

2 结果与分析 2.1 主成分分析

从主成分分析得分散点图(图 1)的结果可以看出，样本全部处于95%置信区间内，部分样本点呈现相互重叠，2组样本区分不明显。

2.2 OPLS-DA及模型验证

由图 2-A可知，样本全部处于95%置信区间内，2组样本区分非常显著。图 2-B中绿色圆点表示置换检验得到的R²Y值(代表在Y轴方向模型的解释率)，蓝色方点表示置换检验得到的Q²值(代表模型的预测率)，2条虚线分别表示R²Y和Q²的回归线。可见原模型R²Y接近1，说明建立的模型符合样本数据的真实情况。Q²Y接近1，说明如果有新样本加入模型，会得到近似的分布情况，总的来说原模型可以很好地解释2组样本之间的差异。同时随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R²和Q²均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性良好。

2.3 差异代谢物的筛选

通过OPLS-DA模型第1主成分的VIP＞1，P值小于0.10，从2组肉牛血清中筛选出16种差异代谢物。由表 2可知，与象草饲粮组相比，芦笋皮饲粮组肉牛血清中代谢物上调的主要有缩二脲、β-谷氨酸、环亮氨酸、脱氧葡萄糖等12种代谢物，下调的主要有L-半胱氨酸、对异丙苯甲酸、N-乙酰色氨酸和异亮氨酸。

2.4 差异代谢物的层次聚类分析

为了更加直观地表示代谢物的组间差异，对差异代谢物进行了层次聚类分析，构建了热图(图 3)，横坐标代表不同组，纵坐标代表该组对比的差异代谢物，不同位置的色块代表对应位置代谢物相对平均值的表达量。由图可见，2组呈现出非常明显的差异代谢物分组模式，差异代谢物主要分为2簇。

2.5 差异代谢物的代谢通路分析

根据差异代谢物进行代谢通路分析发现(表 3)，芦笋皮饲粮与象草饲粮相比，对肉牛代谢通路影响最大的主要是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，其次是精氨酸和脯氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，柠檬酸循环，丁酸甲酯代谢，谷胱甘肽代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢。

3 讨论

粗饲料是反刍动物饲粮的重要组成部分，不同来源的粗饲料，由于养分的差异会对机体代谢产生不同的影响。有研究表明，象草粗蛋白质含量、饲用价值等低于芦笋皮，但是粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维等的含量明显高于芦笋皮^{[5, 14]}。但也有研究表明，象草中脂肪酸含量高，尤其是不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸含量较高^[15]。芦笋皮不仅粗蛋白质含量高，而且还富含维生素B、维生素C及黄酮类生物活性物质，是一种极具潜力的非常规饲料资源^[16]。

本研究将芦笋皮及象草作为粗饲料分别饲喂肉牛，分析发现肉牛的血液代谢轮廓发生了差异变化，最终表征了缩二脲、β-谷氨酸、环亮氨酸、脱氧葡萄糖等16个差异代谢物。缩二脲是一种无味、毒性极低的非蛋白氮物质，在反刍动物养殖中常被用作饲料添加剂。刘海江^[17]开展了肉牛饲粮中缩二脲适宜添加量的研究，结果发现，替代饲粮中20%的蛋白质效益最佳。同样，罗惠娣等^[18]研究表明，缩二脲可作为绵羊饲粮蛋白质饲料的补充料，替代比例为20%~30%时，可降低饲料成本，提高饲养效益。本研究中，饲喂芦笋皮饲粮的肉牛血清中缩二脲含量远远高于象草组，这可能是由于瘤胃中缩二脲的生成速度高于水解速度，而被机体吸收进入到血液中。谷氨酸是参与生物体内蛋白质代谢过程的重要物质之一，也是重要的信号分子和功能性氨基酸，可通过三羧酸循环被彻底氧化，产生大量能量，供机体利用^[19]。亮氨酸在机体内是一种调节因子，可以调控细胞内信号通路，促进肌肉发育，改善肉品质，提高生产性能及免疫功能等^[20]。延胡索酸是三羧酸循环的中间产物，具有增加机体抗氧化能力、促进动物健康等作用^[21]。

研究发现，动物体内过量的L-半胱氨酸可以通过激活小肠上皮细胞内质网应激和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导通路诱导小肠上皮细胞死亡^[22]。对异丙苯甲酸对动物机体而言是一种有害物质，可以降低血压，提高呼吸频率^[23]。N-乙酰色氨酸和异亮氨酸为动物体内氨基酸代谢产物，前者是神经递质5-羟色胺的前体物，5-羟色胺具有收缩血管的功能，后者属于支链氨基酸，可调节机体能量代谢^[24-25]。饲喂芦笋皮的肉牛血清中L-半胱氨酸及对异丙苯甲酸等含量低于象草组，表明前者可能更有利于动物的物质代谢与健康状况。这可能是由于芦笋皮与象草含有不同的营养成分使得动物对饲料的代谢有所不同而引起的结果。Sun等^[26]给泌乳奶牛苜蓿干草或玉米秸秆后，利用气相色谱-飞行时间质谱分析血清代谢物发现，血清中28种代谢物表现出了显著差异。

经过对差异代谢物的分析发现，饲喂芦笋皮和象草引起了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等7个相关代谢通路的扰动，涉及到机体内碳水化合物、氨基酸、维生素、脂类以及核苷酸等物质代谢。本文初步探讨了芦笋皮及象草对肉牛物质代谢的影响，芦笋皮对肉牛营养调控、肉品质及生长代谢影响的代谢机制仍需进一步深入探讨。

4 结论

基于代谢组学技术分析饲喂芦笋皮或象草作为粗饲料的肉牛血清代谢物，找到16个差异代谢物，通过对相关代谢物及代谢通路进行深入分析，发现涉及到7个相关代谢通路，初步证实芦笋皮饲喂肉牛改善了其血清代谢物。