近年来，桑资源的开发应用受到畜牧业的广泛关注，我国利用桑叶养蚕已有上千年的历史，现经过我国科研人员人工选育，培育出了新型抗逆性品种——饲料桑，该品种具有适应性强、产量高、营养丰富等特点，具有极大的开发潜力^[1]。研究表明，在商品育肥猪饲粮中添加10%左右的饲料桑粉对其生长性能没有不良影响^[2]；本课题组前期研究表明，在宁乡花猪饲粮中添加9%发酵饲料桑粉对宁乡花猪生长性能有一定的促进作用，发酵饲料桑粉添加量达到12%时亦无不良影响，且饲料桑含有多种活性成分，主要包括黄酮类(桑酮、桑酮醇)、甾类、生物碱等，黄酮类物质在肠道中可代谢成对雌马酚等益生物质，可提高肠道中双歧杆菌和乳杆菌的数量^[3-4]，且这些活性成分具有抗炎及抗氧化功能^[5-6]。但由于饲料桑含有单宁、植物凝集素等抗营养因子，且具有一定的涩味，大剂量添加至动物饲粮中会导致适口性下降，畜禽采食量降低^[7]，限制了饲料桑在饲粮中的应用。研究发现，发酵工艺能有效降低或去除饲料桑中的抗营养因子，且能降解粗纤维和大分子蛋白质等物质，提高其饲用价值^[8-9]。宁乡花猪作为中国四大名猪品种之一，具有耐粗饲、肉质鲜嫩的优势，但其存在瘦肉率低、肥膘厚等缺点。为了更好地利用饲料桑资源，本试验旨在利用发酵工艺改善饲料桑粉品质后饲喂地方品种宁乡花猪，探讨饲料桑粉对宁乡花猪血清及肝脏抗氧化性能、肠道组织形态和肠道菌群的影响，为饲料桑在畜牧生产中的应用提供数据支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

饲料桑粉由湖南省蚕桑科学研究所提供，经实验室检测营养成分含量为：粗蛋白质22.96%、粗脂肪6.26%、粗纤维9.18%、粗灰分13.90%、钙4.37%和磷0.46%。添加饲料桑粉的发酵试验组采用全发酵方式(将不同比例的饲料桑粉添加至饲粮中后，对其进行发酵处理)，将乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌按2:1:1的比例制成混合菌种，活菌数≥3×10⁹ CFU/g，进行固态发酵处理。发酵设备及试验饲粮由湖南楚沩香农业有限公司提供。

1.2 试验设计

选取90头平均体重为30 kg左右的宁乡花猪，随机分为5个组，每组3个重复(栏)，每个重复6头猪。对照组饲喂基础饲粮，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组分别饲喂添加9%、12%、15%饲料桑粉的全发酵料和9%饲料桑粉的未发酵料。试验于2016年7~9月在湖南宁乡大龙畜牧科技有限公司猪场进行，试验分为2个阶段，中猪阶段(试验期第1~50天)和大猪阶段(试验期第51~75天)。饲粮组成及营养水平见表 1和表 2。

1.3 饲养管理与采样

根据猪场常规程序进行饲养管理。预试期3 d，自由采食、饮水。试验期的第50天，空腹12 h后，各重复(栏)随机选取1头试验猪进行前腔静脉采集血液(10 mL×2)，3 000 r/min离心10 min后收集血清，-20 ℃冻存待测；试验期第75天时，各重复(栏)随机选取1头试验猪进行屠宰，采集血液制备血清待测。试验结束后进行屠宰试验，称取0.1 g左右肝脏组织样品，加入9倍体积的生理盐水后使用匀浆机制成10%的组织匀浆液，再将其在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液待用；分离肠道，收集回肠食糜，封装在5 mL塑料离心管内，-80 ℃冻存，用于回肠微生物测定；将十二指肠、空肠、回肠内容物清除干净后，再用生理盐水冲洗肠道，分别剪取各肠段2 cm置于甲醛固定液中，用于肠道组织形态测定。

1.4 测定指标及方法 1.4.1 血清抗氧化指标

测定2个阶段(第50天和第75天)血清中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒说明书进行指标测定。

1.4.2 肝脏抗氧化指标

测定肝脏中MDA含量、T-SOD和GSH-Px活性以及T-AOC。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒说明书进行指标测定。

1.4.3 肠道组织形态

制作肠道组织切片，观察肠道组织结构，具体测量十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度与隐窝深度比(V/C)。

1.4.4 肠道菌群

利用粪便基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按试剂盒说明书提取试验猪回肠食糜DNA。对DNA样品进行检测，检测合格的样品构建文库委托华大基因完成，内容包括：回收目的Amplicon片段，用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶(PNK)将打断形成的黏性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的Amplicon片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的clean data方可用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成操作分类单位(OTU)，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。

1.5 数据处理与统计分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0软件对数据进行整理，数据以平均值±标准差表示，所有组间进行方差分析，添加9%饲料桑粉全发酵料组与添加9%饲料桑粉未发酵料组进行t检验，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果 2.1 发酵饲料桑粉对宁乡花猪血清抗氧化指标的影响

由表 3可知，相比对照组，添加15%饲料桑粉发酵料组(Ⅲ组)宁乡花猪中期血清T-AOC提高了27.6%，差异显著(P＜0.05)；其余各组间各阶段宁乡花猪血清MDA含量、T-SOD和GSH-Px活性及T-AOC均无显著差异(P＞0.05)。

2.2 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肝脏抗氧化指标的影响

由表 4可知，相比对照组，添加饲料桑粉组宁乡花猪肝脏MDA含量有所降低，肝脏T-SOD和GSH-Px活性有所升高，但差异均不显著(P＞0.05)。

2.3 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道组织形态的影响

肠道组织形态切片见图 1。由表 5可知，与添加9%饲料桑粉未发酵料组(Ⅳ组)相比，添加9%饲料桑粉全发酵料组宁乡花猪十二指肠绒毛高度显著升高(P＜0.05)；与对照组相比，添加9%、12%、15%饲料桑粉全发酵料组及9%饲料桑粉未发酵料组宁乡花猪空肠绒毛高度分别降低了20.18%、23.94%、29.37%和22.05%，差异显著(P＜0.05)；添加12%、15%饲料桑粉全发酵料组及9%饲料桑粉未发酵料组宁乡花猪空肠V/C值分别降低了16.45%、26.11%和17.75%，差异显著(P＜0.05)；与添加9%饲料桑粉未发酵料组相比，添加9%饲料桑粉全发酵料组宁乡花猪空肠V/C值提高了18.10%，差异显著(P＜0.05)；与添加9%饲料桑粉未发酵料组相比，添加9%饲料桑粉全发酵料组宁乡花猪回肠V/C值提高了19.68%，差异显著(P＜0.05)。其余各肠段肠道组织形态指标在各组间均无显著差异(P＞0.05)。

2.4 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道菌群的影响

通过Illumina Hiseq/Miseq平台进行Paired-end测序，下机数据经过去除低质量reads，每个样品数据产出详细统计结果如表 6所示。Paired End Reads通过reads之间的overlap关系拼接成Tags，所有样品一共得到496 489条Tags，平均每个样品35 463条，菌群对数(SD)值为197；Tag平均长度为252 bp，SD值为0。拼接的Tags经过优化后，在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU，统计每个样品在每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。所有样品共产生257个OTU，每个样品OTU统计结果见表 7。

通过与数据库进行比对，对OTU进行物种分类并在门(phylum)和种(species)分类等级上分别选取相对丰度排名前13的门类和相对丰度排名前4的种类绘制物种丰度的profiling面积图和柱状图(图 2和图 3)。如图 2所示，在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)这3种门类的微生物占回肠菌群的95%以上。且在门水平上，添加15%饲料桑粉全发酵料相比其他组别回肠微生物中变形菌门所占比例有下降的趋势。如图 3所示，在种水平上，各饲料桑粉全发酵料组相比未发酵料组罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)相对丰度所占比例更高。

通过对Alpha多样性数据的统计分析发现(表 8)，饲料桑粉全发酵料组宁乡花猪回肠菌群Alpha多样性指数相比未发酵料组，OTU和Chao指数有所提高，但差异不显著(P＞0.05)；各组间香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数均无显著差异(P＞0.05)。

3 讨论 3.1 发酵饲料桑粉对宁乡花猪机体抗氧化性能的影响

由于宁乡花猪特有的生理特点，其体脂含量相对较高，性质活泼的自由基可诱发体内不饱和脂肪酸的氧化，产生脂质过氧化反应，从而降低宁乡花猪肉品质。血清及肝脏中MDA含量、T-SOD和GSH-Px活性以及T-AOC反映了动物机体抗氧化防御系统的水平^[10]。MDA是动物机体由于自由基的氧化作用产生过氧化脂质后分解代谢的产物，其含量越高说明动物机体产生的过氧化脂质越多，机体氧化损伤越严重；T-SOD是被称为动物机体抗氧化系统的第1道防线，可催化机体内超氧阴离子自由基(O^2-·)生成过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂进而与过氧化氢酶(CAT)反应生成水(H₂O)和氧气(O₂)，是机体清除自由基的首要物质；GSH-Px是动物机体内一种具有催化过氧化物分解的酶，可以特异性的催化还原谷胱甘肽，从而使得谷胱甘肽与动物机体内的氢过氧化物发生还原反应，降低机体氧化损伤；T-AOC是动物机体抗氧化系统功能状态的一个综合性指标，反映了动物机体抗氧化系统的总体水平。章丹丹等^[11]研究发现，在桑枝中提取的黄酮化合物在细胞试验和体外化学试验汇总均具有抗氧化活性，有很强的自由基清除能力。周林^[12]从桑枝中分离提纯出黄酮类化合物，通过体外模拟试验同样证明桑枝中黄酮类化合物具有抗氧化活性。本试验研究发现利用饲料桑粉饲喂宁乡花猪可有效提高其血清中T-AOC，且添加15%饲料桑粉全发酵料组血清T-AOC显著高于对照组，这与黄静等^[13]利用桑叶粉饲喂胡须鸡研究结果相似，这可能与饲料桑粉中所含的黄酮类具有的抗氧化活性有关。陈玲玲等^[14]研究桑叶黄酮对糖尿病小鼠的影响中发现，桑叶黄酮可有效提高小鼠肝脏中超氧化物歧化酶活性，降低肝脏中MDA含量。本试验研究发现，饲料桑粉添加组宁乡花猪肝脏MDA含量相比对照组有降低的趋势，肝脏中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC相比对照组均有所提高，说明饲料桑粉可以有效提高宁乡花猪机体抗氧化水平，进而改善肉品质。

3.2 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道组织形态的影响

小肠是动物机体消化吸收营养物质的主要部位，绒毛高度、隐窝深度及V/C值是反映小肠消化吸收功能的重要指标^[15]。小肠黏膜上有大量肠绒毛，绒毛高度越高则小肠对营养物质的吸收面积越大，消化吸收功能越强，绒毛萎缩引起绒毛高度的降低将导致小肠吸收功能的下降；隐窝深度的高低反映了肠上皮细胞的生成率，肠道隐窝的细胞不断的向绒毛处分化，替代补充脱落或损伤的绒毛细胞，隐窝处细胞生成率下降将使隐窝深度变浅，表明绒毛细胞成熟率上升，小肠营养吸收功能增强。有研究表明，隐窝深度还反映了肠上皮细胞的迁移率，隐窝深度降低则表明动物肠上皮细胞的迁移率降低^[16]，动物肠上皮细胞的迁移率降低可以减少能量损失，从而有利于促进动物生产性能^[17]。小肠V/C值可以比较直观地反映小肠的消化吸收能力，V/C值越高则代表小肠消化吸收能力越强。本试验研究发现，饲料桑粉添加组宁乡花猪空肠绒毛高度及V/C值相比对照组有所下降，这可能与饲料桑粉中所含的单宁及植物凝集素等抗营养因子损伤肠道上皮细胞有关，具体原因有待进一步研究；添加9%饲料桑粉全发酵料组相比添加9%饲料桑粉未发酵料组宁乡花猪空肠和回肠V/C值显著提高，且在本课题组前期试验结果表明添加9%饲料桑粉全发酵料对宁乡花猪生长性能有一定的改善作用，说明发酵工艺可能通过降低或清除饲料桑粉中的抗营养因子，从而降低饲料桑粉对宁乡花猪肠道的损伤，进而有益于其生产性能。

3.3 发酵饲料桑粉对宁乡花猪肠道菌群的影响

动物肠道菌群的稳态与宿主的肠道健康状况及生产性能密切相关，肠道菌群的变化也可直接影响动物肠道对营养物质的吸收代谢^[18]。Lamendella等^[19]研究表明，猪肠道内的微生物中的厚壁菌门和拟杆菌门与机体对碳水化合物的代谢有一定相关。本试验研究发现，门水平上，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门这3种门类的微生物占回肠菌群的95%以上；所有宁乡花猪回肠菌群共产生257个OTU，肠道菌群相对丰度越高则越有利于维持动物肠道菌群的稳态，进而促进动物生产性能。吕月琴等^[20]和舒刚^[21]等利用发酵饲料分别在蛋鸡和肉鸡饲养试验中发现，饲喂发酵饲料组相比未发酵饲料组，动物肠道中的乳酸菌等益生菌数量显著提高，大肠杆菌数量有效降低。Canibe等^[22]利用发酵饲料和未发酵饲料饲喂生长猪试验发现，发酵饲料可有效提高动物肠道有益菌数量，有利于促进动物肠道菌群的稳态并提高菌群丰度。本试验研究表明，全发酵料组宁乡花猪回肠菌群Alpha多样性指数相比未发酵料组，OTU和Chao指数有所提高，且各全发酵料组相比未发酵料组乳杆菌种的相对丰度更高，这可能与添加饲料桑粉饲粮经发酵处理后，饲粮pH降低，饲喂宁乡花猪后在肠道中提供了一个适合乳酸菌等喜酸益生菌种的大量繁殖的环境有关，此结果与邝哲师等^[23]利用发酵桑叶粉饲喂胡须鸡试验结果相似，具体原因有待进一步研究。

4 结论

① 饲粮添加15%饲料桑粉全发酵料能显著提高宁乡花猪血清T-AOC。

② 发酵饲料桑粉较未发酵饲料桑粉可显著提高宁乡花猪空肠和回肠V/C值。

③ 发酵饲料桑粉较未发酵饲料桑粉有提高宁乡花猪回肠菌群相对丰度的趋势。