脂肪是动物体生长发育过程中必需的能量物质，它可提供动物体生长发育所需的必需脂肪酸，还可作为脂溶性维生素的载体以及诱食剂^[1]。鱼油富含亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等功能性多不饱和脂肪酸，所以一直作为水产配合饲料的主要脂肪源^[2]。由于鱼油的不饱和程度高，储存过程中容易氧化变质，产生有害的初级、次级氧化产物，包括醛、醇、酮、氢化过氧化物、酯类等，对动物生长性能和机体抗氧化能力产生不同程度的负面影响。近年有关饲料中氧化油脂的研究多集中于鸡^[3-5]、猪^[6-7]、鱼类^[8-9]等养殖动物，研究表明，氧化油脂通过降低饲料的营养价值，使饲料产生异味降低其适口性，导致养殖动物生长性能下降、产品品质降低等^[10-11]。因此，鱼油对于水产动物作用的评价必须结合其营养作用和氧化产物的副作用2个方面来考虑。

方格星虫(Sipunculus nudus)，俗称沙虫，是我国著名的海珍极品，亦是我国重要的渔业资源之一，随着人工室内育苗技术取得突破，方格星虫在我国南部沿海的养殖规模越来越大。方格星虫素有“环境标志生物”之称，对饵料、生长环境等的质量十分敏感，易受有害因素影响，因此养殖过程必须供以优质充足的饵料，以及保持清洁的生长环境。本课题组前期已对方格星虫的营养生理及人工饲料配制开展了系统研究^[12-14]，成功开发出了方格星虫微颗粒饲料。由于方格星虫摄食时间较长、对环境要求特殊，且微颗粒饲料更易被氧化，有必要研究氧化变质油脂对方格星虫生长性能和生理指标的影响。因此，本试验以方格星虫稚虫为研究对象，探讨氧化鱼油对其生长性能、体组成及机体抗氧化相关酶活性的影响，为生产实践中防止因油脂氧化对水产动物造成的损伤及今后进一步研究星虫类动物氧化油脂损伤机制积累基础资料。

1 材料与方法 1.1 氧化鱼油制备

新鲜鱼油由北海恒兴特种饲料有限公司提供，氧化鱼油的制备参考Wang等^[15]的方法。将新鲜鱼油放入1 000 mL烧杯中，置于水浴锅中70 ℃水浴加热，烧杯底部放置洁净气管用气泵鼓入空气。每6 h监测1次过氧化值(peroxide value, POV)，POV采用GB 5009.227—2016中滴定法测定，达到预期POV时，取50 mL氧化鱼油，放入-20 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 试验饲料

在基础饲料中添加5%的新鲜鱼油(POV为1.37 meq/kg)和5种不同氧化程度的鱼油(POV值分别为63.62、151.17、243.89、357.79和457.82 meq/kg)，共制成6种试验饲料，分别用OX0、OX1、OX2、OX3、OX4和OX5表示，其中OX0为对照。试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料制作步骤：固体原料用超微粉碎机粉碎后过100目筛，按配方表设定的各原料添加水平，从低到高依次称量并混合拌匀，再按比例加入卵磷脂手工搓匀，加入适量水揉成面团，用面条机挤成条状烘干后，再次粉碎过筛。称取粉碎的饲料6份，分别加入新鲜鱼油和5种不同氧化程度的鱼油，手工将油脂搓开并混合均匀，加适量水揉成面团，用面条机挤成条状，烘干后粉碎过筛制成微颗粒饲料，保存于-20 ℃备用。

1.3 试验饲料氧化指标测定

试验饲料的POV采用GB 5009.227—2016滴定法测定，酸价(acid value, AV)采用GB 5009.229—2016中冷溶剂指示剂滴定法测定，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用GB 5009.181—2016中分光光度法测定。测定结果见表 2。

1.4 试验设计与饲养管理

试验用方格星虫稚虫为广西海洋研究所海水增养殖基地自主培育的同批人工孵化苗种。选取健康无病、自然状态下体长1.2~1.6 cm、平均体质量为(28.86±0.63) mg的方格星虫稚虫5 400条，以300条为1个重复，3个重复为1组，共分成6个组，分别投喂6种不同添加不同氧化程度鱼油的试验饲料。养殖试验在塑料水槽(65 cm×55 cm×45 cm)中开展，水槽底部铺设细沙(4~5 cm厚)，为方格星虫稚虫提供栖息场所。养殖试验持续8周。每天早、晚(08:00和18:00)各换水1次，每次换水约为总体积的1/3，换水后投喂，采用稍过量投喂，以沙子表面有少量剩料为宜，每周彻底清理水槽1次。试验期间，连续充气，水体温度为27~32 ℃，盐度为18~23，溶解氧浓度大于5.0 mg/L。

1.5 样品收集与分析

饲养试验结束后，将方格星虫稚虫转移至无沙水槽内停食吐沙2 d后，记录存活数量并称重，然后分装于离心管，转入-20 ℃冷冻保存，用于分析常规营养成分和抗氧化酶活性测定。成活率(survival rate, SR)、增重率(weight gain ratio, WGR)和特定生长率(specific growth rate, SGR)的计算公式如下：

饲料和稚虫常规营养成分分析：采用105 ℃常压恒温烘干至恒重法测定水分含量；采用凯氏定氮仪(Kjeltec 8400 Analyzer Unit, Foss, 瑞典)测定粗蛋白质含量；采用索氏抽提仪(Soxtec System 2050, Foss, 瑞典)测定粗脂肪含量；采用马弗炉(天津市泰斯特仪器有限公司)550 ℃灼烧12 h法测定粗灰分含量。

抗氧化酶活性测定：采用整体匀浆法获得方格星虫稚虫待测酶液。将冷冻的稚虫样品在冰盘上用手术剪剪碎后转移至玻璃匀浆器中，加入预冷的磷酸缓冲液(pH=7，质量体积比1 : 1)，充分匀浆，匀浆液用冷冻离心机(C3i, Jouan, 法国)离心10 min(4 ℃、3 000 r/min)，上清液即为待测酶液。采用南京建成生物工程研究所研制的相应试剂盒测定待测酶液中过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性及蛋白质含量。CAT活性定义为每毫克组织蛋白质每秒钟分解1 μmol的过氧化氢(H₂O₂)的量为1个活性单位；SOD活性定义为每毫克组织蛋白质在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个活性单位；GSH-Px活性定义为每毫克组织蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中还原性谷胱甘肽(GSH)含量降低1 μmol/L为1个活性单位。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异达到显著水平(P < 0.05)，则进行Tukey’s多重比较，结果表示为“平均值±标准误”(n=3)。

2 结果与分析 2.1 氧化鱼油对方格星虫稚虫生长性能的影响

由表 3可知，不同氧化程度鱼油对方格星虫稚虫的成活率、终末平均体质量、增重率和特定生长率均有显著影响(P < 0.05)。稚虫的成活率随着鱼油POV的增大呈降低趋势，OX5组显著低于对照组(P < 0.05)。随着鱼油POV的增大，稚虫的终末平均体质量、增重率和特定生长率持续降低，低POV鱼油组(OX1、OX2和OX3组)稚虫与对照组没有显著差异(P>0.05)，而高POV鱼油组(OX4和OX5组)则显著低于对照组(P < 0.05)。

2.2 氧化鱼油对方格星虫稚虫体组成的影响

由表 4可知，不同氧化程度鱼油对方格星虫稚虫的粗蛋白质含量有显著影响(P < 0.05)，对水分、粗脂肪和粗灰分含量的影响不显著(P>0.05)。低POV鱼油组(OX1、OX2和OX3组)稚虫的粗蛋白质含量与对照组没有显著差异(P>0.05)，高POV鱼油组(OX4和OX5试验组)粗蛋白质含量随鱼油氧化值增大而显著降低(P < 0.05)。

2.3 氧化鱼油对方格星虫稚虫抗氧化酶活性的影响

由表 5可知，不同氧化程度鱼油对方格星虫稚虫的CAT活性没有显著影响(P>0.05)，对SOD和GSH-Px活性有显著影响(P < 0.05)。随着鱼油POV的增大，稚虫的SOD和GSH-Px活性有降低的趋势，鱼油POV最高组(OX5组)稚虫的SOD活性显著低于对照组(P < 0.05)，而其他氧化鱼油组(OX1、OX2、OX3和OX4组)则与对照组没有显著差异(P>0.05)，同时OX4和OX5组的GSH-Px活性显著低于对照组(P < 0.05)。

3 讨论

油脂氧化酸败会产生大量具有不良气味的醛、酮等低分子化合物以及过氧化物，与饲料中的蛋白质、维生素等作用引起饲料适口性变差，营养价值和消化率降低^[16-17]。氧化油脂会对养殖动物造成负面影响，主要体现在生产性能下降。卓丽欣等^[18]指出，随着氧化鱼油添加量的增加，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的增重率和特定生长率均显著降低，饲料系数和摄食率则显著升高；吕富等^[19]的研究表明，当饲料POV超过11.38 meq/kg时，双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)的成活率和特定生长率显著下降；陈科全等^[20]报道，饲料中添加氧化鱼油后，草鱼(Ctenopharyngodon idella)的特定生长率和蛋白质沉积率显著下降，而饲料系数和脂肪沉积率显著上升。类似地，氧化鱼油也降低了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)^[15]、真鲷(Pagrus major)^[21]、黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)幼鱼^[22]、罗非鱼(Oreochromis spp.)^[23]、鲤鱼(Cyprinus carpio)^[24]等的生长性能。有研究者提出氧化油脂引起养殖动物生产性能下降可能是饲料酸败适口性下降导致摄食量减少造成的^[25]。但众多的研究中并不是所有试验对象都出现摄食量减少、特定生长率降低的现象，如用含氧化鱼油饲料饲喂大口黑鲈(Micropterus salmoides)后发现其摄食量和特定生长率均出现显著上升^[26]；长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)摄食含氧化鱼油饲料后生长性能没有发生显著变化^[27]。因此，氧化油脂对养殖动物生长性能的影响与各品种对氧化油脂的敏感程度有关，且养殖品种对各有害产物的适应性和代谢方式也有不同。另外，氧化油脂对养殖动物的危害程度还受试验动物生长阶段、油脂种类、油脂氧化方式、油脂氧化程度、饲料组成、试验环境和周期等诸多因素影响^[17]。氧化油脂对养殖动物生理生化的影响机制需进一步深入研究。本研究中，不同氧化程度鱼油对方格星虫稚虫的特定生长率和成活率均有显著影响，随着鱼油氧化程度的加重，稚虫的特定生长率和成活率均持续降低，说明稚虫对饲料中的氧化鱼油极为敏感，氧化鱼油不仅影响了稚虫的生长性能，对其生存也造成了严重威胁，这与同是潮间带底栖动物的双齿围沙蚕的研究结果^[19]类似。

养殖动物摄食含氧化油脂饲料不仅会导致生长性能下降，还会阻碍其对营养物质的消化吸收，使动物体营养价值与品质下降。研究显示，随着饲料POV的增大，双齿围沙蚕的粗蛋白质含量逐渐降低^[19]；草鱼摄食含氧化鱼油饲料后，背肌的粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分含量均显著降低，全鱼粗蛋白质含量也显著降低^[11]；摄食含氧化鱼油饲料后，黄颡鱼的蛋白质沉积率显著下降，其全鱼干物质、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量呈先上升后下降的趋势，但差异不显著^[18]；黑鲷幼鱼的蛋白质效率也在摄食含氧化鱼油饲料后出现降低，鱼体粗蛋白质含量极显著降低^[22]。本试验研究结果与上述研究结果类似，不同氧化程度鱼油对方格星虫稚虫的粗蛋白质含量有显著影响，高POV鱼油组粗蛋白质含量较对照组显著降低。饲料油脂被氧化后，饲料营养价值下降，部分饲料蛋白质就会作为能量被消耗，这可能是高POV鱼油组方格星虫稚虫粗蛋白质含量下降的原因；此外，粗蛋白质含量降低也可能与氧化油脂代谢产物导致用于水产动物机体构建的必需氨基酸缺乏有关^[19]。

CAT、SOD和GSH-Px是生物体抗氧化防御系统中重要的几种内源性抗氧化物酶，抗氧化酶活性可以反映机体氧化-抗氧化状态，从侧面体现动物的健康状态^[28]。研究表明，给试验动物饲喂氧化鱼油可使机体产生大量氧自由基，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加，体内抗氧化酶活性降低，诱导氧化应激^[29]。本研究结果显示，随着鱼油POV的增大，方格星虫稚虫的SOD和GSH-Px活性呈下降趋势，说明方格星虫稚虫摄食含氧化鱼油的饲料后机体抗氧化能力降低。类似地，斑点叉尾(Ietalurus punetaus)^[30]、草鱼^[28]、双齿围沙蚕^[19]等摄食含氧化油脂饲料后也表现为抗氧化酶活性降低，机体抗氧化能力下降。然而，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)^[31]、大黄鱼(Larimichthys crocea)^[32]、大口黑鲈^[26]等在摄食含氧化油脂饲料后抗氧化酶活性反而升高，可能是因为这些养殖品种抗氧化能力较强，也可能与饲料油脂含量和氧化程度不同有关，且不同养殖动物对外界刺激的调节时间也不同。正常情况下生物体内部的氧化与抗氧化保持动态平衡，当机体抗氧化系统受到氧自由基增多的刺激，抗氧化酶活性随之增强，倘若抗氧化体系不能及时清除过多的自由基，就会产生氧化应激，导致抗氧化防御系统受损，机体抗氧化酶活性下降^[30]。本试验中，高POV鱼油组方格星虫稚虫组织已受到氧化损伤，抗氧化防御能力显著降低。

4 结论

由此可见，氧化鱼油会造成方格星虫稚虫生长受阻，死亡率增加，虫体营养价值降低，以及抗氧化能力受损，且随鱼油氧化程度的加重而加剧。