2. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021
2. Institute of Quality and Standard for Agro-Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
动物肠道中栖居着大量的微生物，其中细菌总数多达100万亿，是宿主细胞数量的10倍[1]。不同的消化道解剖部位的微生物数量和种类不同，胃和十二指肠的细菌细胞数量为101~103 CFU/g内容物，至空肠和回肠则上升为为104~107 CFU/g，最后到结肠达到1011~1012 CFU/g[2]。这些微生物直接参与宿主的诸多生理活动，包括发酵宿主不能消化的纤维、果胶等植物多糖产生短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)为宿主供能，促进胆汁酸盐的重吸收及维生素K的合成，提供外源性碱性磷酸酶，促进消化道发育及其免疫系统成熟等，对宿主的食物消化、营养吸收、能量代谢、免疫应答等各项生理功能均产生显著的影响[2-4]。SCFA是肠道菌群代谢的主要产物，可为肠上皮细胞提供能量[5]，同时也能为厌氧菌自身生长提供能量来源，并且能降低肠道内pH，形成酸性环境，抑制有害菌的生长，从而起到改善肠道功能的作用[6-7]。
我国是世界上最大的猪肉生产国和消费国。猪肠道微生物发酵小肠内未消化吸收的碳水化合物和蛋白质等营养成分，产生SCFA为猪提供能量，并通过多种途径影响着猪的营养与健康[1]。大约克猪作为国内目前的重要养殖品种之一，其肠道菌群结构功能备受关注，但是前期有关大约克猪肠道微生物的研究主要集中于粪便[8-9]，而对于整个肠段中菌群结构和SCFA含量的研究未见报道。本试验重点分析了大约克猪肠道不同部位的菌群结构和SCFA含量，并对不同肠道菌群和SCFA进行了相关性分析，为猪肠道微生物功能性调控和进一步提高猪生产力提供技术支撑和参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集试验选用3头体重为(121.00±2.89) kg的180日龄的大约克母猪。屠宰后迅速分离其内脏，取十二指肠全段内容物，以及空肠、回肠、盲肠和结肠中间段内容物，置于灭菌的离心管中，用液氮速冻后，置于干冰中，带回实验室保存与-80 ℃冰箱中。
1.2 样品DNA提取用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN，加拿大)试剂盒抽提不同肠段内容物微生物基因组DNA，按照试剂盒使用说明进行操作。使用Nanodrop 2000测定提取的DNA纯度和含量，并采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.3 细菌相对丰度的RT-PCR分析参照Xu等[10]的引物序列对不同肠段中的细菌总数、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度进行RT-PCR分析，细菌总数引物为5′-CGGYCCAGACTCCTACGGG-3′和5′-TTACCGCGGCTGCTGGCA-3′，厚壁菌门引物为5′-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3′和5′-AGCTGACGACAACCATGCAC-3′，拟杆菌门引物为5′-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3′和5′-AGCTGACGACAACCATGCAG-3′。RT-PCR使用SYBR Green PCR Master Mix(Takara，日本)在ABI 7500型定量PCR仪(ABI，美国)中进行。PCR体系为10.0 μL体系，包括5.0 μL SYBR Green qPCR mix，上、下游引物各0.5 μL，根据不同浓度细菌总DNA添加不同体积样品量以保证体系中总细菌DNA的量一致。RT-PCR条件设置：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；58 ℃，45 s；72 ℃，1 min；35个循环。每个样品做3个平行。根据测得的Ct值与标准曲线得到样品中DNA拷贝数，采用2-△△Ct对定量结果进行整理分析。
1.4 高通量测序及数据分析以提取的DNA为模板，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S rRNA基因V3~V4区进行PCR扩增。采用Illumina Hiseq 2500测序平台对PCR扩增产物进行测序。使用QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V1.7.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)对测序数据进行分析[11]，统计97%相似性水平上各样本的操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)数量。使用Sliva和RPD数据库对所有OTU的代表性序列进行物种匹配。使用Unifrac和主坐标分析(PCoA)进行样品间beta多样性分析。
1.5 SCFA含量的测定参照Xiao等[9]的方法，取0.1 g左右的肠内容物，至1.5 mL离心管中，加入9倍体积(mL)的mQH2O，涡旋混匀后，12 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 mL至2 mL离心管中。随后加入0.1 mL的25%(质量体积比)偏磷酸与巴豆酸混合溶液(巴豆酸作为内标)，-20 ℃保存过夜。上样前，经过0.22 μm滤膜进行过滤，过滤后再12 000 r/min离心10 min，然后取500 μL上清液于气相色谱(GC)分析仪测定SCFA含量。色谱条件为：色谱柱采用毛细管色谱柱(InertCap FFAP)，柱温110 ℃，汽化室温度180 ℃；使用火焰离子化检测仪(FID)，检测温度180 ℃；载气为氮气，压力为60 kPa，氧气压力50 kPa，氢气50 kPa，灵敏度为10-1，衰减3.0。
1.6 数据处理对不同肠段菌群结构及SCFA含量间的差异进行one-way ANOVA检验，P < 0.05为显著性差异。菌群结构与SCFA的相关性使用Pearson相关性系数进行分析。
2 结果 2.1 大约克猪不同肠段微生物的相对丰度通过RT-PCR分析发现，细菌总数、厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度，从十二指肠至结肠均表现为增加的趋势(表 1)，其中在大肠段(盲肠和结肠)显著高于小肠段(十二指肠、空肠和回肠)(P < 0.05)。
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表 1 大约克猪不同肠段微生物的相对丰度 Table 1 Relative abundance of microorganisms in different gut locations of Yorkshire pigs |
本试验最终获得511 192条有效序列，其中序列数量最少的样品为30 753条，最多为43 162条。所获得的有效序列根据97%相似性水平进行OTU聚类分析，十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠样品获得的OTU(即observed species)数量(平均值±标准差)分别为450±43、497±65、552±27、593±20和605±28(图 1-A)。维恩图显示各肠段样本的共有OTU为414个，占各样本OTU数量的绝大多数(图 1-B)。各样品的稀释曲线均趋于平缓，其覆盖度指数(goods coverage)均为0.999~1.000。
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A：各肠段样品的OTU数量(observed species) OTU numbers of samples from each gut location (observed species)；B：维恩图Venn diagram。 图 1 大约克猪各肠段样品OTU信息统计 Fig. 1 OTU data of samples from each gut location of Yorkshire pigs |
大约克猪盲肠和结肠样品的香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数显著高于十二指肠、空肠和回肠，回肠、盲肠和结肠样品的Chao1指数和ACE指数显著高于十二指肠和空肠(P < 0.05)(表 2)。这表明肠道菌群的丰富度和多样性随消化道走向自上而下逐渐增加。
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表 2 大约克猪不同肠段样品alpha多样性分析 Table 2 Alpha diversity analysis of samples from different gut locations of Yorkshire pigs |
在门水平上，厚壁菌门在各肠段细菌群落中均占绝对优势(>75%)，其中在回肠中相对丰度最高(87.3%)，其他相对丰度较高的门还包括：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、无壁菌门(Tenericutes)和纤维杆菌门(Fibrobacteres)(图 2-A和图 2-B)。其中变形菌门在盲肠和结肠的相对丰度显著低于在十二指肠、空肠和回肠(P=0.034 9)，而拟杆菌门的相对丰度自十二指肠至结肠和盲肠逐渐增加(P < 0.000 1)。在属水平上，厚壁菌门的乳杆菌属(Lactobacillus)、SMB53、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、罗氏菌属(Roseburia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和粪球菌属(Coprococcus)，变形菌门的弧菌属(Vibrio)和不动杆菌属(Acinetobacter)，以及拟杆菌门的普氏菌属(Prevotella)相对丰度较高(图 2-C和图 2-D)。其中，乳杆菌属在十二指肠、空肠和回肠中的相对丰度依次增加，但在盲肠和结肠中显著降低(P=0.024 5)；而链球菌属的变化趋势正好相反，在结肠中的相对丰度显著高于其他肠段(P=0.028 8)。此外，普氏菌属(P=0.001 9)、罗氏菌属(P=0.003 5)和粪球菌属(P < 0.000 1)的相对丰度随肠道移行逐渐增加；而葡萄球菌属(P=0.010 2)和不动杆菌属(P=0.008 3)的相对丰度则逐渐降低。
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A、B：在门的水平上at the phylum level；C、D：在属的水平上at the genus level；A、C：各样品的菌群结构bacterial composition of individual samples；B、D：各肠段的平均菌群结构average bacterial composition of each gut location。 Others：其他；Fibrobacteres：纤维杆菌门；Tenericutes：无壁菌门；Cyanobacteria：蓝藻门；Euryarchaeota：广古菌门；Spirochaetes：螺旋体门；Actinobacteria：放线菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Coprococcus：粪球菌属；Acinetobacter：不动杆菌属；Staphylococcus：葡萄球菌属；Roseburia：罗氏菌属；Prevotella：普氏菌属；Clostridium：梭菌属；Vibrio：弧菌属；Streptococcus：链球菌属；Lactobacillus：乳杆菌属。 1~3：十二指肠duodenum；4~5：空肠jejunum；7~9：回肠ileum；10~12：盲肠cecum；13~15：结肠colon。 图 2 大约克猪不同肠段样品菌群结构(前10) Fig. 2 Microbial community structure of samples from different gut locations of Yorkshire pigs (top 10) |
通过基于相对丰度最高的35个属进行热点图(图 3)分析发现，盲肠和结肠中瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属、粪球菌属、颤螺菌属(Oscillospira)、罗氏菌属、毛螺菌属(Lachnospira)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、CF231和厌氧弧菌属(Anaerovibrio)的相对丰度显著高于小肠段(P < 0.05)。
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图 3 大约克猪不同肠道微生物相对丰度最高的35个属热点图 Fig. 3 Heatmap of 35 bacterial genera with the highest relative abundance from different gut locations of Yorkshire pigs |
根据各个样品OTU的种类及其相对丰度计算样品间的遗传距离，表示为加权和非加权Unifrac距离矩阵(图 4-A)。PCoA结果(图 4-B)显示，各肠段样品在主效应1(PC1)维度上表现出明显的组内聚集，且十二指肠、空肠和回肠样品与盲肠和结肠样品彼此远离。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析(图 4-C)同样表明，十二指肠与空肠样品中菌群的遗传距离较近，其次为回肠，与盲肠和结肠距离较远，而后两者之间菌群相似度较高，拥有较近的遗传距离。
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A：加权(括号外)和非加权(括号内)Unifrac距离Weighted (outside brackets) and unweighted (inside brackets) Unifrac distances；B：菌群结构的主坐标分析PCoA of bacterial community structures；C：UPGMA聚类分析UPGMA cluster analysis。 图 4 大约克猪不同肠段样品beta多样性分析 Fig. 4 Beta diversity analysis of samples from different gut locations of Yorkshire pigs |
通过对大约克猪各肠段内容物中SCFA的含量进行分析发现(图 5)，乙酸、丙酸和丁酸含量较高。盲肠和结肠是SCFA的主要产生部位，而小肠段(十二指肠、空肠和回肠)中各类SCFA含量均显著降低(P < 0.05)。
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标有不同字母的组间具有显著性差异(P < 0.05)。 There is a significant difference among the groups labeled with different letters (P < 0.05). 图 5 大约克猪不同肠段内容物中SCFA含量 Fig. 5 SCFA content in contents from different gut locations of Yorkshire pigs |
由于结肠段SCFA含量最为丰富，取结肠段菌群与SCFA含量进行相关性分析发现(图 6)，拟杆菌属、普氏菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、SMB53、罗氏菌属、密螺旋体属(Treponema)和瘤胃球菌属与SCFA含量呈显著的正相关(P < 0.05)。
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图 6 大约克猪结肠菌群结构与SCFA含量的相关性分析 Fig. 6 Correlation coefficient between bacterial community structures and SCFA content in colon of Yorkshire pigs |
由于肠道不同解剖部位的生理状态不同，因此各肠段的菌群数量、组成和结构也均存在差异[1]。本研究发现，从十二指肠至结肠中细菌总数、厚壁菌门和拟杆菌门均在显著增加。根据各肠段样品的OTU所绘制的维恩图显示，绝大多数OTU均为各肠段所共有。而alpha多样性分析显示，由十二指肠至结肠，菌群的丰富度和多样性随消化道走向逐渐增加。
物种注释进一步显示了各肠段菌群结构的异同，十二指肠、空肠和回肠中超过90%的细菌属于厚壁菌门和变形菌门，其中厚壁菌门占绝对优势，且其优势延伸至盲肠和结肠；但变形菌门的比例在盲肠和结肠中显著降低，而拟杆菌门相应增加，与厚壁菌门一起构成了盲肠和结肠的优势菌群(＞90%)，与文献报道[1, 12]一致。在属的水平上，乳杆菌属、SMB53、梭菌属和弧菌属为十二指肠、空肠和回肠中相对丰度最高的属；而盲肠和结肠中的乳杆菌属、弧菌属、葡萄球菌属和不动杆菌属的相对丰度显著降低，瘤胃球菌属、拟杆菌属、普氏菌属、粪球菌属、颤螺菌属、罗氏菌属、毛螺菌属、粪杆菌属、CF231和厌氧弧菌属的相对丰度显著升高。beta多样性分析显示，十二指肠、空肠和回肠中菌群相似度较高，而盲肠和结肠的菌群相似度较高。这种差异可能与各肠段的生理状态和功能密切相关，十二指肠与胃相连，主要为抗酸性的革兰氏阳性需氧菌，如乳酸杆菌；空肠和回肠中细菌数量逐渐增加，需氧或兼性厌氧的细菌比例升高；而大肠中中性或弱碱性的环境有利于细菌的大量繁殖，所以结肠成为肠道细菌数量最多、多样性最高的部位，厌氧菌如拟杆菌、粪球菌和链球菌相对丰度明显增加[13]。
除消化道解剖位置外，各肠段不同的消化生理功能对肠道菌群组成和结构具有重要的影响。猪肠道内与碳水化合物代谢有关的微生物主要为厚壁菌门和拟杆菌门细菌，大多数厚壁菌门细菌能分泌胞外多糖降解酶，而变形菌门细菌多数与蛋白质发酵有关[14-16]。本试验表明，大约克猪小肠中以厚壁菌门和变形菌门为主，可能与饲粮中的淀粉多糖和蛋白质的降解有关。随着绝大多数饲粮蛋白质在小肠中被消化[17]，大肠中变形菌门的丰度显著下降；而随着饲粮中非淀粉多糖等纤维在小肠中逐渐降解为可溶性寡糖，为拟杆菌门细菌提供了适宜的可利用底物，因此后者丰度明显升高[9]。
由于细菌连续的代谢活动，结肠内的氧化还原电位很低，适合严格厌氧微生物的繁衍。因此，大约克猪盲肠和结肠中厌氧的瘤胃球菌属、拟杆菌属、普氏菌属、颤螺菌属、罗氏菌属、毛螺菌属和粪杆菌属等相对丰度显著升高，这些均为典型的SCFA产生菌[18]。梭菌属是肠道中主要的纤维降解菌，能有效降解半纤维素和纤维素，释放可溶性寡糖[19-20]。而拟杆菌门细菌如普氏杆菌属主要参与寡糖、淀粉、果胶等多种可溶性多糖的降解，但对纤维素降解能力较差[21]。本试验显示大约克猪盲肠和结肠内容物中各类SCFA含量显著高于小肠段，与盲肠和结肠中高丰度的SCFA产生菌相一致，表明肠道中拟杆菌属、普氏菌属、魏斯氏菌属、罗氏菌属、密螺旋体属和瘤胃球菌属等与SCFA产生呈现正相关。
4 结论① 大约克猪小肠和大肠中的菌群丰度、多样性及结构有显著差异。小肠(十二指肠、空肠和回肠)中以厚壁菌门和变形菌门为主，盲肠和结肠菌群以厚壁菌门和拟杆菌门为主。
② 盲肠和结肠拟杆菌属、普氏菌属、魏斯氏菌属、罗氏菌属、密螺旋体属和瘤胃球菌属等典型SCFA产生菌的相对丰度较高，同时其SCFA含量也显著高于小肠段，表明二者呈显著正相关。
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