2. 广东海洋大学动物科学系, 湛江 524088;
3. 广州爱保农饲料有限公司, 广州 510310
2. Department of Animal Science, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China;
3. Guangzhou Applon Technology Co., Ltd., Guangzhou 510310, China
怀乡鸡是华南地区著名的肉鸡品种，也是我国重点保护的28个地方鸡种之一，具有采食性好、耐粗饲、适应性强、抗病力强等优点，而且其色泽美观、肌肉丰满、肉质嫩滑、骨软皮脆，从而名扬港澳及东南亚地区，在我国广东、广西及周边地区广泛养殖[1]。然而，怀乡鸡至今没有系统的营养需要数据资料和配套饲养标准，实际生产中配制饲粮主要参考我国黄羽肉鸡的饲养标准或其他地方鸡种的营养需要，不能精准提供其营养需要，限制了其生长潜力的充分发挥，肉品质也受到了严重影响[2]。研究怀乡鸡饲粮中非植酸磷(NPP)的适宜水平，对规范化、集约化饲养怀乡鸡，制订其饲养标准，充分发挥怀乡鸡的生产潜能具有重要的意义。以往对怀乡鸡的研究主要集中于生长性能、肉用性能、产蛋性能等种质特性的分析[1, 3-5]，与贵妃鸡、速生型黄鸡的杂交利用[6-7]，也有个别针对其营养需求的研究[8-10]，但关于怀乡鸡对能量、蛋白质、微量养分需要的报道很少。磷作为动物必需的矿物元素之一，在鸡体骨骼发育和代谢过程中发挥着至关重要的作用，饲粮中过高或过低的磷水平都会对畜禽的生长发育产生不良影响。当前国内外学者通过体增重、骨骼参数、血清、组织磷含量或相关分子表达指标估测动物对磷的需要时，多采用折线模型进行趋势分析确定最佳水平[11-13]，而不同的统计模型估测的动物养分需要量存在较大差异[14]，每一个指标的剂量效应反应有其最适合的拟合模型。本试验拟通过研究饲粮中NPP水平对0~4周龄怀乡鸡生长性能、胫骨特性、钙与磷代谢率及血清生化指标的影响，探讨反映怀乡鸡NPP营养状况的敏感指标，并采用多种曲线模型对其剂量效应反应进行拟合分析[15]，筛选最佳拟合曲线，确定0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平。
1 材料与方法 1.1 试验饲粮试验采用玉米-豆粕型基础饲粮[添加低分子壳聚糖(分子质量 < 5 000 u，占饲粮的0.58%)]，主要综合黄羽肉鸡的饲养标准和生长速度相近的地方肉鸡的营养需要配制[7, 16-18]。采用单因子完全随机设计，共设置5个无机磷(磷酸二氢钾)添加水平，分别为0、0.07%、0.14%、0.21%、0.28%。通过调整基础饲粮中细沙粒的用量来满足试验设计中磷酸二氢钾的添加水平，配制5种试验饲粮，所用细沙粒为洗净的建筑沙，未检测到磷。因玉米-豆粕基础饲粮中NPP水平为0.32%，故5种试验饲粮中NPP水平分别为0.32%、0.39%、0.46%、0.53%、0.60%。各试验饲粮中除了NPP水平形成梯度差异外其他营养成分均保持一致，钙水平为1.00%，维生素D3水平为1 250 IU/kg。每个试验饲粮的配料均经过均匀度检验达到合格(GB/T 5918—2008)，确保磷添加剂及各组分分布的均匀性和含量的准确性。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验采用单因子完全随机设计，选用健康、体重相近的1日龄怀乡鸡(公鸡)300只，随机分为5组，每组6个重复，每个重复10只鸡。5组试鸡分别饲喂NPP水平为0.32%、0.39%、0.46%、0.53%、0.60%的试验饲粮，试验期28 d。试鸡采用70 cm×60 cm×35 cm的3层层叠式笼养，粉料饲喂，自由采食和饮水，对鸡群进行常规保温、通风和免疫接种。
1.3 样品采集与指标测定 1.3.1 生长性能以重复为单位称量试鸡初重和末重，统计每周的耗料量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)，并详细观察和记录鸡的腿病和健康状况，统计死亡只数，计算成活率。
1.3.2 血清生化指标饲养试验结束后，将试鸡空腹12 h，然后从各个重复中选取接近平均体重的试鸡2只，称取活重后，翅静脉采血各4 mL，合为1个样品，离心(3 000 r/min，10 min)获得血清，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定血清钙、磷含量和碱性磷酸酶活性，严格按照说明书进行。
1.3.3 胫骨特性试鸡采血后屠宰，取左侧胫骨，仔细去除周围的肌肉、筋腱及经膜组织，用于测定胫骨重、胫骨抗压强度以及胫骨灰分、钙、磷含量。胫骨抗压强度采用YYW-2型应变控制式无侧限压力仪测定；将胫骨置于65~70 ℃风干，后用滤纸包裹后，放入乙醚中浸泡48 h脱脂，再置于(105±2) ℃烘至恒重得到胫骨脱脂干重；胫骨灰分、钙及磷含量分别采用灰化法(GB 6438—2002)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)络合滴定法(GB/T 6436—2002)及钼黄分光光度法(GB/T 6437—2002)测定。
1.3.4 养分代谢饲养试验结束后，分别从各个重复中选取1只试鸡，采用全收粪法进行代谢试验，预试期3 d，正试期为3 d，每天早、晚各收粪1次，称重后立即添加10%的硫酸溶液，并冷藏。待代谢试验结束，将每个重复的鸡只粪便样品混匀，风干。取试验饲粮和粪便样品，分别测定饲粮和粪便样品中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、钙、磷含量，计算养分代谢率。
1.4 数据统计与分析对采集的数据采用Excel 2010软件进行初步整理，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用SAS 9.2软件中的一般线性模型(GLM)过程进行单因素方差分析，用LSD法进行多重比较。对差异显著的敏感指标采用二次曲线模型(y=b0+b1x+b2x2)、线性折线模型[y=b0+b1(b2-x)]和二次折线模型[y=b0+b1(b2-x)2]进行曲线拟合分析[15]，以P<0.05作为各项数据差异显著性判断标准和拟合曲线的显著性水平；根据决定系数(R2)筛选各敏感指标的最佳拟合曲线并确定0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平。
2 结果与分析 2.1 饲粮NPP水平对0~4周龄怀乡鸡生长性能的影响由表 2可知，饲粮NPP水平对怀乡鸡的初重和平均日采食量没有显著影响(P>0.05)，但对末重、平均日增重和料重比有显著影响(P < 0.05)，表明末重、平均日增重和料重比可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况。进一步拟合分析得出，末重的最佳拟合曲线为二次折线[y=280.22-322 9.68×(0.39-x)2，R2=0.852 0]，即随着饲粮NPP水平的增加，末重先呈曲线上升，NPP水平达到0.39%时转折，而后呈平台期；平均日增重的最佳拟合曲线为线性折线[y=9.17-8.04×(0.39-x)，R2=0.854 1]，即随着饲粮NPP水平的增加，平均日增重先直线上升，NPP水平达到0.39%时转折，而后呈平台期；料重比的最佳拟合曲线为二次曲线(y=2.98-4.08x+4.37x2，R2=0.900 1)，即随着饲粮NPP水平的增加，料重比先曲线上升，达到拐点后再曲线下降，其拐点时的NPP水平为0.47%。本试验中观察到，饲粮NPP水平低于0.39%的2个组有少量试鸡死亡，但未观察到明显腿病，各组成活率差异不显著(P>0.05)。
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表 2 饲粮非植酸磷水平对0~4周龄怀乡鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary NPP level on growth performance of Huaixiang chickens aged from 0 to 4 weeks |
由表 3可知，饲粮NPP水平对怀乡鸡的胫骨抗压强度及灰分、钙含量有显著影响(P < 0.05)，对其他胫骨特性指标没有显著影响(P>0.05)，表明胫骨抗压强度及灰分、钙含量均可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况。进一步进行拟合分析得出，胫骨抗压强度及灰分、钙含量的最佳拟合曲线分别为二次曲线(y=-78.29+709.22x-783.79x2，R2=0.887 2)、二次折线[y=51.04-64.10×(0.46-x)2，R2=0.904 3]及线性折线[y=18.70-4.76×(0.46-x)，R2=0.900 7]，得出怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平分别为0.45%、0.46%、0.46%。
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表 3 饲粮非植酸磷水平对0~4周龄怀乡鸡胫骨特性的影响 Table 3 Effects of dietary NPP level on tibia characteristics of Huaixiang chickens aged 0 from to 4 weeks |
由表 4可知，饲粮NPP水平对怀乡鸡的粗灰分、钙和磷代谢率有显著影响(P < 0.05)，但对干物质、粗蛋白质和粗脂肪代谢率没有显著影响(P>0.05)，表明粗灰分、钙和磷代谢率可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况。进一步进行拟合分析得出最佳拟合曲线，其中粗灰分代谢率呈线性折线[y=15.18-24.07×(0.46-x)，R2=0.964 3]、钙代谢率呈线性折线[y=37.97-29.86×(0.42-x)，R2= 0.876 2]、磷代谢率呈二次曲线(y=-11.59+ 205.69x-209.45x2，R2=0.941 1)，其拟合结果均可用于评价怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平，其结果分别为0.46%、0.42%、0.49%。
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表 4 饲粮非植酸磷水平对0~4周龄怀乡鸡养分代谢率的影响 Table 4 Effects of dietary NPP level on nutrient metabolism rates of Huaixiang chickens aged from 0 to 4 weeks |
由表 5可知，饲粮NPP水平对怀乡鸡血清磷含量有显著影响(P < 0.05)，对血清钙含量、钙磷比及碱性磷酸酶活性没有显著影响(P>0.05)，表明血清磷含量可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况。进一步进行趋势分析发现，随着饲粮NPP水平的增加，血清磷含量先线性上升，当NPP水平达到0.45%时转折，而后呈平台期，最佳拟合曲线为线性折线[y=12.89-6.14×(0.45-x)，R2=0.946 3]，用血清磷含量评价怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平，结果为0.45%。
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表 5 饲粮非植酸磷水平对0~4周龄怀乡鸡血清生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary NPP level on serum biochemical indices of Huaixiang chickens aged from 0 to 4 weeks |
为了更客观地求测0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平，将各敏感指标的最佳拟合方程汇总为表 6。结果表明，0~4周龄怀乡鸡末重、平均日增重、料重比、胫骨抗压强度、胫骨灰分含量、胫骨钙含量、粗灰分代谢率、钙代谢率、磷代谢率、血清磷含量共10个指标均可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况，并随着饲粮NPP水平的增加分别呈二次曲线、线性折线或二次折线变化，均可用来评价怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平。其中末重、平均日增重、胫骨抗压强度、钙代谢率这4个指标拟合得出的NPP适宜水平分别为0.39%、0.39%、0.45%、0.42%，但其拟合曲线的R2小于0.9，而料重比、胫骨灰分含量、胫骨钙含量、粗灰分代谢率、磷代谢率、血清磷含量这6个指标拟合得出的NPP适宜水平分别为0.47%、0.46%、0.46%、0.46%、0.49%、0.45%，其拟合曲线的R2均大于0.9，可更为准确地求得饲粮中NPP的适宜水平。
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表 6 汇总各敏感指标的最佳拟合曲线及非植酸磷适宜水平 Table 6 Summarize the best fitted curves for sensitive indicators to assess the appropriate level of NPP |
饲粮磷水平的设置是磷营养需要研究的关键设计环节，过高或过低均不利于得出准确的结果。本试验中怀乡鸡饲粮中NPP水平和变化梯度的确定，是通过综合比较与怀乡鸡生长和产肉性能相近的多个肉鸡品种的已有饲养标准、营养需要研究结果或实践饲养数据得以确定。
怀乡鸡是2014年列入国家品种资源保护名录的广东省3大鸡种之一，饲养过程分为3个阶段：0~4周龄、5~8周龄、9~17周龄，初生重30 g，4周龄体重近300 g，17周龄上市，体重达1 500 g[1]。怀乡鸡属于肉用鸡种，肉质鲜美、色泽美观，具有皮黄、毛黄、脚黄的“三黄鸡”特色。鉴于怀乡鸡的外观、生长特点及产肉性能，本试验中，试验饲粮中NPP水平和梯度的确定参考了黄羽肉鸡0~4周龄的营养需要量(0.45%)和与怀乡鸡生长和产肉性能相近的贵妃鸡与麒麟鸡的研究结果[17-18]。贵妃鸡和麒麟鸡均为地方肉鸡品种，其生长速度分别稍慢和稍快于怀乡鸡(4周龄体重分别为220、380 g)，研究得出的饲粮NPP适宜水平分别为0.51%、0.39%。另外，本试验还参考了怀乡鸡生长性能测定试验中饲粮NPP水平数据(0.37%)，采食该饲粮的试验鸡未观察到明显的腿病、骨骼异常等磷缺乏问题[7]。刘松柏[11]指出，饲粮NPP水平小于0.23%时会严重影响1~21日龄肉仔鸡的成活率。综合上述资料和研究，本试验设定的饲粮NPP水平在涵盖上述研究的最大和最小范围的同时稍有扩展，设定在0.32%~0.60%，5种试验饲粮中NPP水平分别为0.32%、0.39%、0.46%、0.53%、0.60%，递增梯度为0.07%。本试验得出的NPP水平适宜范围在0.45%~0.49%，落在试验设定的中间范围，说明本试验中NPP水平范围的设计是合理的。
3.2 试验方法及拟合模型的选择磷需要量的研究方法主要包括剂量反应法、析因法、平衡试验法、屠宰试验法，在肉鸡磷需要量的研究中，由于剂量反应法简单易行，一般都采用该方法估测肉鸡磷需要量[19]。选择估测动物养分需要量的统计分析方法也很重要，因为用不同的统计方法估测的动物养分需要量存在较大差异[14]，目前常见的统计方法有方差分析、多重比较、二次曲线模型、折线模型(线性折线模型)和一种渐近线模型，也有人提出二次折线模型和其他多种渐近线模型(酶动力学模型、指数模型、对数模型和S型曲线模型)[20]。其中，方差分析与多重比较是最基础的，是比较笼统的一种统计方法，属于逐点分析法，该方法忽略了变量之间反应变数是连续的特点，所以不能准确而有效地得出养分需要量，仅用此法可能会低估动物的养分需要量，所以一些研究人员建议采用曲线拟合可以较为准确客观地评价动物对某养分的需要量[21-22]。但不同的曲线模型各有特点，是否适合于试验特定的敏感指标对饲粮剂量反应的点分布特征取决于拟合模型的拟合程度(R2)及显著性(P值)。鉴此，本试验选用了多种模型用于模拟同一个敏感指标的剂量效应反应，从中选择最佳的拟合模型(拟合程度最高)，以更准确评价饲粮中NPP的适宜水平。Wang等[22]利用肉鸡赖氨酸需要量研究比较了9种曲线模型，发现二次曲线可准确用于评价肉鸡赖氨酸需要量；另外4种渐进线模型(二次折线模型、4参数对数模型、酶动力学模型和S型曲线模型)也能很好地拟合大部分试验，但其曲线反应规律逐渐逼近最大剂量反应，而不能达到最佳点，所以只能通过总反应的95%所在曲线上的点对应的X轴截点计算得出最佳剂量[23]。Pesti等[24]认为二次折线模型综合了二次曲线模型和渐进线模型的优势，既有比较好的拟合度，也可得出最佳点，是评定养分需要量可行有效的一种方法。因此，本试验选择二次曲线模型、线性折线模型和二次折线模型进行各敏感指标曲线拟合。
3.3 0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平本试验结果表明，0~4周龄怀乡鸡末重、平均日增重、料重比、胫骨抗压强度、胫骨灰分含量、胫骨钙含量、粗灰分代谢率、钙代谢率、磷代谢率、血清磷含量等10个指标均可敏感反映怀乡鸡体内磷营养状况，其中料重比、胫骨灰分含量、胫骨钙含量、粗灰分代谢率、磷代谢率、血清磷含量这6个指标拟合程度更高，可更为准确地评价NPP需要量，因此根据后者结果建议0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP水平在0.45%~0.49%。据报道，4~18日龄是肉仔鸡骨骼形成的关键时期，4~11日龄是骨矿化的关键时期[25]，所以，研究怀乡鸡0~4周龄磷需要量对于肉鸡全期的生长发育至关重要。在估测动物某一养分的需要量时，选择合适的敏感指标相当重要[26]。有报道指出，生长性能、血液和组织磷含量、胫骨特性、胫骨骨密度及趾骨灰分含量均是评价肉鸡磷需要量的敏感指标[11]，本研究采用上述敏感指标评价饲粮中NPP的适宜水平。但由于饲粮中非植酸磷水平的测定尚无标准方法，故本试验饲粮中NPP水平采用了计算值而非实测值。本试验根据怀乡鸡的平均日增重得出饲粮中NPP的适宜水平仅为0.39%，该结果和同时期生长速度较快的肉用仔鸡和黄羽肉鸡(0~4周龄均为0.45%)相比明显偏低；和同时期生长速度较慢的地方良种鸡相比，与麒麟鸡[18]完全一致，但远远低于贵妃鸡[17]和种用型矮小型黑羽乌骨鸡[27]。可见，不同生长速度的肉鸡，对矿物磷的需要量有一定差距，有些肉鸡的生长速度虽然比较慢，但对矿物磷的需要量更高，而生长速度相近的地方良种肉鸡，矿物磷需要量也不尽一致，这可能与不同鸡种的骨骼特性存在差别有关。
4 结论① 料重比、胫骨灰分含量、胫骨钙含量、粗灰分代谢率、磷代谢率、血清磷含量可敏感反映怀乡鸡体内磷的营养状况，并可用于准确评价NPP的需要量。
② 综合上述6个敏感指标的拟合方程结果，得出0~4周龄怀乡鸡饲粮中NPP的适宜水平为0.45%~0.49%。仅满足0~4周龄怀乡鸡生长的NPP需要量为0.39%，而满足其骨骼发育的NPP需要量为0.46%。
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