2. 亚太兴牧(北京)科技有限公司, 北京 100193;
3. 农业部饲料生物技术重点开放实验室, 北京 100081
2. Beijing Animore Science & Technology Co., Ltd., Beijing 100193, China;
3. Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
花鲈(Lateolabrax japonicus)属凶猛肉食性鱼类，其肉质细嫩、味道鲜美，深受人们的喜爱，且生长速度快，对盐度和温度的适应范围较广，是我国海水养殖的主要种类之一[1]。
蛋白质是生命的物质基础，也是水产动物所必需的重要营养物质，花鲈对蛋白质需求量较高，研究表明花鲈配合饲料中蛋白质的最适含量为39.9%~43.1%[2-3]。从饲料中摄入的蛋白质被消化分解为氨基酸，供机体所利用，所以鱼类对蛋白质的需求实际上是对氨基酸的需求，其中必需氨基酸对鱼类有着非常重要的生理作用[4]。精氨酸是鱼类的必需氨基酸，不同鱼类品种对精氨酸的需求量差异较大。目前，关于花鲈对饲料中精氨酸需求量尚未见报道，NRC(2011)[5]显示, 与花鲈分类地位较为接近的海水肉食性鱼类尖吻鲈(Lates calcarifer)和欧鲈(Dicentrarchus labrax)的精氨酸需求量分别为2.0%和1.8%，占饲料蛋白质的4.1%和3.9%。Ngamsnae等[6]报道了银鲈(Bidyanus bidyanus)的精氨酸需求量为2.7%，约占饲料蛋白质的6.8%。此外，Kaushik等[7]以全鱼氨基酸结构为理想蛋白质模式确定的肉食性鱼类精氨酸需求量约占饲料蛋白质的6.16%。研究表明适量补充精氨酸可以调控生长和营养代谢，提高鱼类的生长性能、抗氧化能力和免疫反应[8-9]。但是，目前精氨酸价格昂贵，且存在对其他氨基酸代谢产生干扰的问题，不适合在规模化水产饲料生产中使用[10]，因此，通过调控内源性精氨酸的合成来增加机体精氨酸的供给是一种经济、有效的策略。
N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为尿素循环中间体N-乙酰谷氨酸(NAG)的稳定类似物[11]，可以激活精氨酸合成过程中的关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS-Ⅰ)，促进内源性精氨酸的合成[12]，并且NCG相比于直接添加NAG，有成本低、吸收率高、在体内代谢稳定等优势[13]。目前，对于NCG的研究主要是集中在母猪、仔猪和反刍动物等陆生动物上，有研究表明饲粮中补充NCG可以有效增加仔猪[13-15]和羔羊[16]的精氨酸内源性合成、提高生长性能和促进肌肉蛋白质合成。但NCG在水产动物上应用的研究较少。研究表明饲料中添加NCG能够提高大菱鲆(Scophthalmus maximus)[17]的生长性能、减少尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[18]肝脏脂肪的沉积和改善镜鲤(Cyprinus carpio)[19]的免疫反应。因此，开展NCG在肉食性水产动物饲料中的相关研究对养殖过程中补充精氨酸的不足以及促进水产养殖业的健康发展有指导意义。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验用水产靶动物为花鲈，购自山东省威海市裕隆鱼场，试验正式开始前，试验鱼在养殖系统中暂养数周，暂养期间投喂含35%鱼粉的基础饲料(精氨酸含量为1.98%、粗蛋白质含量为43.7%，均为风干基础上的实测值)。
1.2 试验饲料试验用NCG由亚太兴牧(北京)科技有限公司生产，NCG标示值≥97%。在花鲈基础饲料(精氨酸含量为1.98%，约占饲料蛋白质的4.5%)中分别添加0(对照)、120、240、360、480、720 mg/kg的NCG，并依次命名为N0、N120、N240、N360、N480、N720。试验饲料组成及营养水平见表 1，试验饲料氨基酸组成见表 2。试验饲料中所用鱼粉包括15%进口鱼粉(999低温干燥级，丹麦)和20%国产鱼粉(山东斥山鱼粉厂，荣成)。在配制饲料时，将微晶纤维素和NCG按照配方中的量先预混合到预混料中，然后各饲料原料按照添加量从小到大顺序逐级搅拌混匀，制成粒径2.0 mm的双螺杆挤压膨化浮性饲料(TSE65型，现代洋工机械，北京)，自然晾干后于-20 ℃冰箱保存备用。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
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表 2 试验饲料氨基酸组成(干物质基础) Table 2 Amino acid composition of experimental diets (DM basis) |
养殖试验在国家水产饲料安全评价基地(北京，南口)室内循环流水养殖系统中进行。随机挑选体质健康、个体均匀的花鲈幼鱼[平均初始体重为(11.67±0.02) g]，分配到容积为0.26 m3的36个圆锥形养殖桶中，每个养殖桶放养30尾。将36桶试验鱼随机分配到6个组中，每组6个重复(养殖桶)，试验期为10周。每天表观饱食投喂2次，投喂时间分别为08:00、16:00。定期检测水质，水质条件保持在溶氧(DO)浓度>7.0 mg/L，总氨氮浓度 < 0.3 mg/L，pH=7.5~8.5，水温(26±2) ℃。
1.4 样品采集试验开始时，取12尾鱼作为初始全鱼样品，每4尾作为1个混合样品。10周养殖试验结束时，每桶鱼饥饿24 h后称重，计数。每桶取3尾鱼作为终末全鱼样品，全鱼样品检测水分、粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪含量。每桶再随机取3~4尾鱼，用80 mg/L三氯叔丁醇(上海国药集团化学试剂有限公司)麻醉，分别测量其体长(自吻端至椎骨末端的长度)、体重，之后尾静(动)脉取血，加入30 μL/mL抗凝剂(2%氟化钠+4%草酸钾)，在4 ℃、4 000 r/min的条件下离心10 min，取上层血浆保存于-80 ℃的冰箱中待测。将取血后的鱼解剖，取内脏、肝脏和腹腔脂肪(腹脂)分别称重，并将取肝脏样品真空冷冻干燥后-80 ℃保存，用于测定肝脏脂肪含量。
1.5 指标测定 1.5.1 生长指标和形体指标各指标计算公式如下：
摄食率(feeding rate，FR，%)=100×总摄食量/试验天数；
存活率(survival rate，SR，%)=100×终末鱼数量/初始鱼数量；
增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×体增重/初始体重；
特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×(ln初始均重-ln终末均重)/试验天数；
饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=摄食量/(终末鱼重+死亡鱼重-初始鱼重)；
肥满度(condition factor，CF，g/cm3)=平均体重/平均体长3；
肝体比(hepatosomatic index，HSI，%)=100×肝脏重/体重；
脏体比(viscerasomatic index，VSI，%)=100×内脏重/体重；
腹脂率(abdominal fat percentage，AFP，%)=100×腹脂重(g)/全鱼重(g)；
蛋白质沉积率(protein retention ratio，PRR，%)=100×(终末总重×终末鱼体粗蛋白质含量-初始总重×初始鱼体粗蛋白质含量)/(总摄食量×饲料粗蛋白质含量)；
脂肪沉积率(fat retention ratio，FRR，%)=100×(终末总重×终末鱼体粗脂肪含量-初始总重×初始鱼体粗脂肪含量)/(总摄食量×饲料粗脂肪含量)。
1.5.2 营养成分分析分别采用105 ℃常压干燥法(GB/T 6435—2006)、凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)、550 ℃灼烧法(GB/T 6438—2007)、酸水解全脂肪测定法(GB/T 6433—2006)测定全鱼和饲料样品中粗蛋白质、粗脂肪、水分、粗灰分的含量。采用IKA-C2000氧弹量热仪测定饲料样品的总能，采用酸、氧化水解法(GB/T 18246—2000)测定饲料样品中17种氨基酸的含量。
1.5.3 血浆生化指标检测血浆葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和一氧化氮(NO)含量以及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，在酶标仪(Bio-Tek)上测定。
1.6 数据统计分析试验数据以平均值±标准误(mean±SE)表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法多重比较检验组间差异的显著性，显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 饲料中添加不同水平NCG对花鲈生长性能的影响饲料中添加不同水平NCG对花鲈生长性能的影响见表 3。各组花鲈存活率都在97.5%以上，各组之间终末均重、增重率、脂肪沉积率和特定生长率无显著差异(P>0.05)。高剂量NCG添加组(N480组和N720组)的摄食率和饲料系数有升高的趋势，其中N480组摄食率显著高于N240组和N360组(P < 0.05)，饲料系数显著高于N0组和N240组(P < 0.05)。N240组的蛋白质沉积率与N360组无显著差异(P>0.05)，显著高于其他各组(P < 0.05)。以上结果说明饲料中适量添加NCG能够提高花鲈对饲料中蛋白质的利用效率，增加鱼体蛋白质沉积，降低饲料中氮排放，减少对水环境的压力。因此，本试验选取蛋白质沉积率为评价指标，进行折线模型分析，得到花鲈蛋白质沉积率最高时NCG添加水平为219.2 mg/kg(图 1)。
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表 3 饲料中添加不同水平NCG对花鲈生长性能的影响 Table 3 Effects of diets supplemented with different levels of NCG on growth performance of Lateolabrax japonicus |
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图 1 饲料中NCG添加水平与花鲈蛋白质沉积率之间关系的折线模型分析 Fig. 1 Broken-line model analysis of relationship between dietary NCG supplemental level and PRR of Lateolabrax japonicus |
饲料中添加不同水平NCG对花鲈形体指标和体成分的影响见表 4。脏体比和肝体比各组之间无显著差异(P>0.05)；N120组的肥满度显著高于N720组(P < 0.05)，其他各组之间无显著差异(P>0.05)。随饲料中NCG添加水平的增加，花鲈腹脂率呈先下降后上升的趋势，N240组最低，显著低于N480组(P < 0.05)；虽然肝体比各组之间没有显著差异，但肝脏脂肪含量随饲料中NCG添加水平的增加总体表现为先缓慢下降后逐渐升高的变化趋势，以N360组最低，显著低于N0组和N120组(P < 0.05)。以上结果说明饲料中适量添加NCG能够有效减少花鲈腹部和肝脏脂肪的蓄积，结合脂肪沉积率呈现出先上升后下降的趋势，可推测NCG具有促使脂肪向肌肉转移的功能。饲料中添加不同水平NCG对花鲈全鱼粗蛋白质、粗脂肪、水分、粗灰分含量均无显著影响(P>0.05)。因此，本试验选取腹脂率为评价指标，进行折线模型分析，得到花鲈腹脂率最低时NCG添加水平为214.3 mg/kg(图 2)。
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表 4 饲料中添加不同水平NCG对花鲈形体指标和体成分的影响 Table 4 Effects of diets supplemented with different levels of NCG on morphometric parameters and body composition of Lateolabrax japonicus |
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图 2 饲料中NCG添加水平与花鲈腹脂率之间关系的折线模型分析 Fig. 2 Broken-line model analysis of relationship between dietary NCG supplemental level and AFP of Lateolabrax japonicu |
饲料中添加不同水平NCG对花鲈血浆生化指标的影响见表 5。血浆GLU、TC、LDL-C含量以及ALT、AST活性各组间无显著差异(P>0.05)。N120组血浆UN含量显著低于N0组和高剂量NCG添加组(N480组、N720组)(P < 0.05)。N120组血浆TG含量显著低于N0组和N360组(P < 0.05)，其他各组间无显著差异(P>0.05)。N240组血浆HDL-C含量显著高于N360组和N720组(P < 0.05)，其他各组间无显著差异(P> 0.05)。血浆NO含量以N360组最高，显著高于N480组(P < 0.05)。
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表 5 饲料中添加不同水平NCG对花鲈血浆生化指标的影响 Table 5 Effects of diets supplemented with different levels of NCG on plasma biochemical parameters of Lateolabrax japonicus |
精氨酸是鱼类的必需氨基酸，不同来源和不同加工条件的饲料原料中精氨酸的含量差异很大，不同发育阶段和不同食性的鱼类对精氨酸的需求量也存在着较大差异(在饲料中添加量为1.1%~3.1%或占饲料蛋白质的2.8%~8.1%)[20-21]。一般来说，生长速度较快的幼鱼期对精氨酸的需求量大于成鱼期，肉食性鱼类对精氨酸的需求量要高于杂食性鱼类[22]。目前，多种鱼类对精氨酸的需求量已有报道，包括斑点叉尾(Ietalurus punetaus)、鲤(Cyprinus carpio)、印度鲤(Catlo carpio)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、太平洋鲑(Oncorhynchus spp.)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等，大部分品种对精氨酸的需求量占饲料蛋白质的4.0%以上[20]。花鲈作为广温广盐肉食性鱼类，对鱼粉依赖性较强，相比草食性或杂食性鱼类更难利用植物蛋白质[23]，对精氨酸需求量更高。虽然目前尚没有关于花鲈精氨酸需求量的报道，但鱼类肌肉氨基酸组成可作为饲料必需氨基酸需求量的理想蛋白模型[24]。王远红等[25-26]分析了不同产地、不同规格野生及养殖花鲈肌肉中氨基酸组成，发现其精氨酸含量为4.38%~5.40%，占蛋白质的5.27%~5.38%。在本研究中，经过10周的养殖，饲料中添加不同水平NCG对花鲈的增重率和特定生长率没有产生显著影响，但添加240~720 mg/kg NCG不同程度地提高了鱼体的蛋白质沉积率，这表明基础饲料(N0组)中精氨酸含量(1.98%，约占饲料蛋白质的4.5%)尚未满足花鲈对精氨酸的需求。有研究表明，饲料中缺乏精氨酸会导致银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch)、欧洲鲈鱼和印度鲮(Cirrhinusmrigala)等鱼类蛋白质合成下降，从而导致蛋白质沉积量及体蛋白质含量下降[27-29]，而添加过多的精氨酸又会造成赖氨酸等必需氨基酸的吸收障碍[30]。另有研究表明，适量补充精氨酸对动物有益，包括提高黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和条纹鲈鱼(Moronesaxatilis)的生长性能、改善肉质、提高免疫反应[8-9]、减少育肥猪脂肪沉积和增加蛋白质沉积[31]等。目前，精氨酸太昂贵而不能用于商业鱼类饲料，并且在一些鱼类中存在吸收不同步的问题，这会干扰其他氨基酸代谢[10]。因此，增加鱼类内源性精氨酸合成是一种经济、有效的策略。
NCG作为鸟氨酸循环中间体NAG的稳定类似物，通过激活肠道P5CS和CPS-Ⅰ(鸟氨酸循环和精氨酸合成途径中限速酶)促进内源性精氨酸的合成[13]，进而提高生产性能[17]，这在哺乳动物和部分鱼类中已经得到证实[18-19, 32]。相比于直接添加精氨酸，NCG具有代谢稳定、不和其他氨基酸产生拮抗、效率高和安全等优点。在本研究中，各组花鲈存活率都达到了97.5%以上，且各组的增重率和特定生长率没有显著差异，添加高剂量(480~720 mg/kg)NCG有提高摄食率和饲料系数的趋势，说明高剂量添加NCG可能会对养殖水体造成排放压力。但是，饲料中添加240 mg/kg的NCG显著提高了花鲈的蛋白质沉积率，蛋白质沉积能力反映了花鲈的生长性能、氨基酸的吸收利用效率以及肉品质，说明适量添加NCG可有效地促进鱼体蛋白质沉积、降低饲料中氮排放，减少对水环境的压力。因此，本试验选取蛋白质沉积率为评价指标，进行折线模型分析，得到花鲈蛋白质沉积率最高时的NCG添加水平为219.2 mg/kg。这与尚晓迪等[17]报道的在饲料中添加200~227 mg/kg NCG显著提高大菱鲆肌肉中精氨酸含量、增重率和蛋白质效率的结果接近。但程炜轩等[18]研究得出，在饲料中添加2 000 mg/kg的NCG能有效提高尼罗罗非鱼的增重率、蛋白质效率以及血浆中精氨酸含量。此外，Wang等[19]研究发现，在饲料中添加1 200和1 600 mg/kg的NCG能有效提高镜鲤的生长性能、氧化能力和免疫能力，同时血浆精氨酸含量显著提高。适量添加NCG能够提高血浆和肌肉中精氨酸的含量说明镜鲤、罗非鱼和大菱鲆能够利用NCG内源性合成精氨酸。NCG在不同鱼类饲料中最适添加水平有较大差异可能和食性有关，花鲈和大菱鲆都属于肉食性鱼类，而罗非鱼和镜鲤属于杂食性鱼类。虽然鱼类利用NCG合成精氨酸的研究报道有限，但从以上结果趋势推测肉食性鱼类利用NCG内源合成精氨酸的效率比杂食性鱼类更高。此外，有研究表明饲料中精氨酸过量时对不同鱼类生长的影响存在明显的种间差异，过量精氨酸对肉食性鱼类的生长具有抑制作用[33]。本试验中，在添加高剂量(480~720 mg/kg)NCG时花鲈反而出现蛋白质沉积率下降，也可能是因为精氨酸合成过量导致赖氨酸效价降低，具体原因还需要进一步研究分析。
3.2 饲料中添加不同水平NCG对花鲈形体指标及体成分的影响目前全球鱼粉资源有限且价格居高不下，使得在水产养殖中使用高脂饲料来节约蛋白质成为一种趋势[34-35]。然而，高脂饲料或者氨基酸不均衡的饲料经常导致养殖鱼类的肝脏和腹部蓄积大量脂肪，引起代谢紊乱[36]，导致脂肪肝和内脏脂肪蓄积[37]。花鲈肉质鲜美、生长迅速，是优质的水产养殖品种，但是目前集约化水产养殖中的高密度，特别是在网箱养殖中，导致鱼类活动减少，加上广泛使用低蛋白质和高脂肪水平的配合饲料，导致鱼体脂肪蓄积严重[38]。腹腔脂肪蓄积使鱼类营养代谢失调、生产性能降低，造成免疫系统紊乱，导致鱼类的抗病能力下降，容易暴发疾病，在受到环境应激性刺激(如拉网、运输、水温突变、水质不良等)时易发生应激性出血综合征，甚至大量死亡[39]。在本研究中，随着NCG添加水平的增加，花鲈的腹脂率和肝脏脂肪含量呈现出先下降后升高的趋势，其中添加240 mg/kg NCG时腹脂率最低，添加360 mg/kg NCG时肝脏脂肪含量最低，说明适量添加NCG可有效减少肝脏和腹腔脂肪的蓄积，这与在尼罗罗非鱼[18]、猪[40]和绿头鸭(Anas platyrhynchos Linnaeus)[41]上所得结果相似。体脂主要沉积在肝脏、腹腔和肌肉中，有研究表明精氨酸调节脂肪组织和肌肉组织之间的脂质分布[42]。在本研究中，随着饲料中NCG添加水平的增加，花鲈的脂肪沉积率呈现出先上升后下降的趋势，其中添加240~360 mg/kg NCG时脂肪沉积率较高，腹脂率和肝脏脂肪含量较低，推测NCG具有促使脂肪向肌肉转移的趋势。本试验选取腹脂率为评价指标，进行折线模型分析，得到花鲈腹脂率最低时的NCG添加水平为214.3 mg/kg。
3.3 饲料中添加不同水平NCG对花鲈血浆生化指标的影响血液、血浆或血清生化指标与鱼类机体代谢，营养水平及疾病有着密切的联系，它既能反映鱼类的正常生理状态，也可用于评价其病理学变化，是衡量鱼体是否处于相对健康状态的一项重要指标[43]。在本研究中，各组花鲈血浆GLU含量以及ALT和AST活性无显著差异，说明添加120~720 mg/kg NCG没有对花鲈造成肝功能损伤。研究表明精氨酸缺乏会导致蛋白质合成下降、代谢异常、血浆和肝脏中TG含量增加[44]以及诱导脂肪肝的发生[45]。在本研究中，饲料中添加120 mg/kg NCG显著降低血浆中尿素氮，尿素氮可以准确地反映动物体内氨基酸平衡和蛋白质代谢情况，说明适量添加NCG可通过内源性合成精氨酸提高花鲈对蛋白质的利用效率，减少氮排放。
HDL-C是血管清道夫，能促进外周组织中胆固醇的消除，代表鱼体脂肪代谢转运系统的运转能力[46]，其含量下降，不利于胆固醇的代谢、转运和清除，将影响肝脏的正常脂肪代谢[47]。在本研究中，饲料中添加240 mg/kg的NCG显著提高了血浆中HDL-C的含量，同时在饲料中添加120~360 mg/kg NCG降低了血浆中TG的含量，说明适量添加NCG可以改善花鲈的脂肪代谢，这与在育肥猪[40]、肉鸡[48]和大鼠[49]上所得结果类似。此外，刘艳妍等[50]和Fouad等[48]研究发现精氨酸能够通过下调脂肪合成关键酶——脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA的表达，上调脂肪酸氧化过程中限速酶——肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)mRNA的表达，改善獭兔和肉鸡血脂代谢，降低血浆TG和腹部脂肪含量。精氨酸-NO途径在免疫调节中发挥重要作用，在体内，精氨酸是NO的唯一前体，NO在体内起到信号转导的作用，可增强机体的免疫能力[51]。有研究表明，在饲料中添加精氨酸或NCG可以通过提高血浆中NO含量来提高幼建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[52]、团头鲂(Megalobrama amblycephala)[51]和镜鲤的抗氧化能力和免疫反应。在本研究中，饲料中添加360 mg/kg NCG可有效提高血浆中NO的含量，说明适量添加NCG可提高花鲈的免疫能力。
4 结论在花鲈饲料中适量添加NCG可以有效提高鱼体蛋白质沉积、减少肝脏和腹腔脂肪蓄积，改善蛋白质和脂肪代谢。分别以蛋白质沉积率、腹脂率为评价指标，通过折线模型分析得出，花鲈蛋白质沉积率最高时NCG添加水平为219.2 mg/kg，腹脂率最低时NCG添加水平为214.3 mg/kg。综合考虑得出，花鲈饲料中的NCG适宜添加水平为214.3~219.2 mg/kg。
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