在奶牛的饲粮中添加不饱和脂肪酸(UFA)是提高乳成分的重要途径[1]。在人类与奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)中添加亚油酸(LA)可影响与细胞增殖凋亡、转录因子激活、营养代谢及免疫反应相关基因的表达[2]。先前的研究表明，增加乳脂前体物(如LA)的供应，可促进乳脂的合成，提高产奶量，却降低了乳蛋白的合成[3]。乳蛋白合成的下降可能是由于在奶牛饲粮中添加乳脂前体物质会阻碍用于合成乳蛋白的氨基酸转运，减少血液和乳腺中氨基酸的摄入量[4]。然而，He等[5]研究却得出了不一致的结果，其研究结果显示奶牛饲粮中添加植物油后乳蛋白含量保持不变。此外，奶牛灌注共轭亚油酸使乳蛋白含量增加[6]，而这可能与其可显著上调瘦素和α-酪蛋白(CSN1S1)基因的表达有关[7]。综上所述，添加乳脂前提物对乳蛋白的合成有显著的影响，但结果却不尽一致，而针对LA在不同培养模式下BMECs中乳蛋白合成影响的研究鲜见报道。
使用合适的培养体系能够更好地维持BMECs组织学特征。由于在二维(2D)培养模型中生长的BMECs缺乏乳腺上皮细胞的极化结构和类腺泡结构，既不能完全反映乳腺上皮细胞的生理特征，也不能维持其组织的特异性结构、机械/生化信号以及细胞间的信号传导[8]。然而，由于2D培养的易操作和低成本的特点，大多数实验室都使用2D培养模型进行相关研究。随着泌乳功能研究的深入，能够更好地模拟体内条件的三维(3D)培养方法应运而生。相比之下，3D培养的BMECs可以使细胞生长在多孔的、类似细胞外基质的支架/空间结构上，更好地模拟乳腺结构在体内的生长环境，且类腺泡结构在培养基中可以保持数周[9]。然而，大多数体外研究都是在人类或小鼠的原代乳腺上皮细胞上进行[10-11]，而对于BMECs在3D培养模型中的形态和生物学功能的研究还鲜见报道。因此，本试验旨在研究不同培养模式下BMECs的形态是否存在差异及培养基中添加不同浓度LA对BMECs中乳蛋白合成相关基因表达的影响是否存在差异。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验采用单因子完全随机试验设计。将P3代的BMECs接种在铺有基质胶(Matrigel)的6孔板中，在培养的前3 d每天更换培养基。培养至第3天时，在培养基中添加不同浓度(0、40和80 μmol/L)的LA，作用48 h后，测定乳蛋白合成相关基因的表达。在2D和3D培养模型的BMECs中添加相同浓度的LA，比较2D和3D培养模型的BMECs在细胞形态和乳蛋白合成相关基因表达方面的差异。每个组3个重复，每个重复3个孔。
1.2 BMECs的2D培养BMECs是从健康经产且身体状况良好的荷斯坦奶牛乳腺中分离得到。BMECs的2D培养参照Yonezawa等[12]，具体方法如下：选取大约1 cm3的乳腺组织，加入到500 U/mL胶原酶Ⅱ中(体积比1 : 3)，在37 ℃和5% CO2培养箱中消化1 h，并通过80目尼龙网过滤，去除大的组织碎片。收集滤液后转入离心管中在800×g下离心5 min，弃去上清液后，用生长培养基[生长培养基为添加10%胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL HE琼脂(HE)及5 μg/mL胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)的DMEM/F12培养基]重悬细胞，置于37 ℃和5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至80%汇合，然后分别添加含不同浓度LA的DMEM/F12诱导培养基，置于37 ℃和5% CO2培养箱中继续培养24 h，使用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞，将细胞悬液离心10 min(800×g)，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗，收集细胞，用于提取细胞RNA。
1.3 BMECs的3D培养BMECs的3D培养参照王秀美[13]，具体方法如下：将1 mL Matrigel铺入细胞培养6孔板内，然后将6孔板置于培养箱30 min，待胶凝固，将培养纯化的第2代BMECs按3×106个/mL的密度悬浮于生长培养基中(生长培养基为添加2% Matrigel、5% FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL HE及5 μg/mL ITS溶液的DMEM/F12培养基)，将2 mL细胞悬液接种于包被了Matrigel的细胞培养板内，置于37 ℃和5% CO2培养箱中培养5 d。开始培养时为第0天，前3 d每天更换生长培养基。培养至第3天后添加含有不同LA浓度(0、40和80 μmol/L)的分化培养基(分化培养基为添加2% Matrigel、2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL HE及5 μg/mL ITS的DMEM/F12培养基)，在细胞培养过程中使用倒置相差显微镜观察细胞生长状态并拍照。
细胞培养结束后，吸出细胞培养液后用PBS冲洗3次。随后每孔(6孔板)加入2 mL的细胞回收液，用细胞刮刀将胶刮下来转移到50 mL离心管中(提前预冷)，以上步骤重复3次。然后置于冰上1 h，待胶完全解聚。将细胞悬液离心10 min(800×g)，弃去上清液，用PBS清洗，收集细胞沉淀，用于提取细胞RNA。此过程中所用的试验器材与试剂均需4 ℃提前预冷，冰上操作。
1.4 BMECs中乳蛋白合成相关基因表达的测定BMEC中总RNA的提取采用RNAiso plus试剂盒(TaKaRa，日本)按说明书进行。用紫外分光光度计在260和280 nm处对RNA进行定量和定性测定。采用1.5%琼脂糖凝胶水平电泳测定RNA完整性。cDNA的合成按照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa，日本)说明书进行。实时荧光定量PCR反应按照试剂盒SYBR Premix Dimer EraserTM进行操作，其扩增条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；95 ℃，30 s。本试验以泛素表达转录因子(UXT)、线粒体核糖体蛋白L39(MRPL39)、真核翻译起始因子3亚基K(EIF3K)为内参基因，分别检测乳蛋白合成相关基因[CSN1S1、κ-酪蛋白(CSN3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、真核翻译启始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)、信号转导转录激活因子5(STAT5A)、核糖体p70s6激酶(RPS6K1)]的表达，各基因表达量用2-△△Ct值表示。引物序列及参数见表 1。
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表 1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters |
2D或3D培养模型中不同浓度之间数据的比较利用SAS 9.0软件的ANOVA程序进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较。2D或3D培养模型中同一测定指标的比较用t检验进行分析。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 BMECs在2D和3D培养模型中的形态观察BMECs在2D和3D培养模型中的形态见图 1。如图所示，BMECs在2D培养模型中展现出鹅卵石的形态(图 1-A)，这是典型的乳腺上皮细胞形态。BMECs在3D培养模型中形成了腺泡样结构(图 1-B、图 1-C、图 1-D)。细胞在接种24 h后，细胞间形成类似于网络状的结构，散布在Matrigel的表面。随后，BMECs在Matrigel的表面不断地迁移聚集，形成具有类腺泡结构，类似于动物体内正常的乳腺腺泡结构。
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图 1 BMECs在二维和三维培养模型中的形态 Fig. 1 Morphology of 2D and 3D culture model in BMECs |
如表 2所示，乳蛋白合成相关基因在3D培养模型中的表达量均显著高于2D培养模型中的表达量(P < 0.05)。与2D培养模型相比，3D培养模型中乳蛋白合成相关基因的表达量至少增加了9倍以上；40 μmol/L LA组中CSN3的基因表达量提高幅度最大，提高了1 334倍以上。
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表 2 二维和三维培养模型中不同LA浓度下BMECs乳蛋白合成相关基因表达影响的比较 Table 2 Comparison on effects of 2D and 3D culture models on expression of milk protein synthesis related genes in BMECs with different LA concentrations |
如图 2所示，在3D培养模型中，与0 μmol/L LA组相比，添加40和80 μmol/L LA显著下调了CSN1S1和RPS6K1的基因表达量(P < 0.05)。而80 μmol/L LA组CSN3和AKT1的基因表达量显著高于0和40 μmol/L LA组(P < 0.05)。与0 μmol/L LA组相比，添加40 μmol/L LA显著上调了STAT5A和EIF4EBP1的基因表达量，添加80 μmol/L LA显著下调了STAT5A的基因表达量(P < 0.05)。
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2D：二维；3D：三维。数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 2D: two-dimension; 3D: three-dimension. Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). 图 2 亚油酸对二维和三维培养模型中BMECs乳蛋白合成相关基因表达的影响 Fig. 2 Effects of LA on expression of milk protein synthesis related gene in BMECs in 2D and 3D culture models |
在2D培养模型中，与0 μmol/L LA组相比，添加40和80 μmol/L LA显著下调了CSN1S1、mTOR、CSN3、RPS6K1和AKT1的基因表达量(P < 0.05)，添加40 μmol/L LA显著上调了STAT5A和EIF4EBP1的基因表达量(P < 0.05)。
综上，CSN1S1、STAT5A、EIF4EBP1和RPS6K1基因的表达在2D和3D培养模型中的趋势一致，而CSN3、mTOR和AKT1基因的表达在2D和3D培养模型中却呈现相反的变化趋势。
3 讨论在本研究中，BMECs在2D培养模型中呈现出鹅卵石的形态，这与Kozƚowski等[14]的结果相一致，其研究结果表明BMECs在传统的2D生长模式下呈现出单层的鹅卵石形态。以原代小鼠乳腺上皮细胞为模型的研究表明，3D培养模型中的细胞能够形成类似腺泡的球体结构[15-16]。在本试验中，3D培养模型中的BMEC在第3天也形成了类腺泡结构。2D和3D培养模型不仅对BMECs的形态结构有显著的影响，对某些基因的表达也存在着显著的影响。细胞表面的跨膜受体可以识别基底膜基质，受体与配体结合诱导细胞骨架重排和一系列细胞内信号转导，最终改变基因表达[17-18]。在本试验的3D培养模型中，细胞与细胞以及细胞与基质之间的相互作用导致细胞骨架重排，最终改变了细胞信号转导通路。此外，在3D培养模型中形成的类腺泡结构能使细胞表面受体活性位点暴露，能够更有效地与周围环境协同工作，为营养调节提供条件，这可能是本试验中在相同的营养和激素条件下，3D培养模型中BMECs乳蛋白相关基因表达量显著高于2D培养模型中基因表达量的主要原因。当然，基因的表达也受到其他因素的影响，培养模式是否是主要因素还有待进一步研究。
CSN1S1和CSN3是BMECs中2个主要的酪蛋白基因，其mRNA表达水平与乳蛋白合成高度相关[19]。Mach等[3]研究表明，在奶牛饲粮中添加不饱和脂肪酸，降低了乳蛋白含量。本试验结果表明，在BMECs培养基中添加80 μmol/L LA显著下调了CSN1S1的基因表达量，这可能是在奶牛饲粮中添加不饱和脂肪酸使乳蛋白含量降低的主要原因之一，其具体机制仍有待进一步研究。在本试验中，在2D培养模型中，与对照组相比，添加80 μmol/L显著下调了CSN3的基因表达量，而3D培养模型中CSN3的基因表达量显著上调。这样的结果可能是因为在3D培养模型中LA能促进mTOR和STAT5A信号通路，而这些信号转导通路能够调节CSN3的合成[20-21]。营养物质和激素可以通过mTOR和Janus激酶-信号转导子和转录激活因子5(JAK-STAT5)活化的JAK-STAT5通路可以促进BMECs的分化和乳蛋白基因表达，并诱导乳腺AKT1的表达[22]。相比之下，mTOR信号转导通路可以通过整合氨基酸、能量和激素信号来调节乳蛋白代谢[23]。研究表明，雷帕霉素可抑制mTOR的表达从而降低了体外合成蛋白质的产量[13]。本试验结果表明，LA可通过调节mTOR和JAK-STAT5通路相关基因的转录水平来促进BMECs中CSN3基因的表达。此外，研究表明细胞膜表面上的催乳素受体在3D培养模型中是完全暴露的[13]，当STAT5A与完全暴露的催乳素受体结合后，STAT5A被激活，被激活的STAT5A转移到细胞核，连接乳蛋白基因启动子区域，从而促进乳蛋白基因的表达[24-25]，这也可能是3D培养模型能够促进STAT5A基因的表达，从而促进CSN3基因的表达的主要原因。此外，本试验结果表明在培养基中添加LA，参与乳蛋白合成的相关基因(EIF4EBP1、RPS6K1、STAT5A、CSN1S1)的表达趋势在2D和3D培养模型中几乎一致。综上所述，3D培养模型对于研究BMECs中依赖于培养基中的激素的乳蛋白相关基因的表达更有效，尤其是针对AKT1、CSN3和mTOR基因的转录调控的研究更有效。
4 结论① BMECs在2D培养模型中呈现鹅卵石的形态，而在3D培养模型中呈现腺泡样结构。BMECs中乳蛋白合成相关基因在3D培养模型中的表达量显著高于其在2D培养模型中的表达量。
② CSN1S1、STAT5A、EIF4EBP1和RPS6K1的基因表达量在2D和3D培养模型中的变化趋势一致，而CSN3、mTOR和AKT1的基因表达量在2D和3D培养模型中却呈现相反的变化趋势。
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